一、方法概述

 

用甲醇稀释提取饲料或饲料原料（如霉变小麦）中呕吐毒素，提取液经过滤、旋干浓缩、甲醇溶解后，加入培养基和ANSB714种子液，37℃暗处培养。反应结束后，用免疫亲和柱 -高效液相色谱法测定其中呕吐毒素的含量，从而确定邦霉解对呕吐毒素的降解率。

二、仪器和设备 

实验室常规仪器、设备及下列各项。

2.1  分析天平                        Sartorius

2.2  320-S型pH计                   METTLER

2.3  YX-280D型高压蒸汽灭菌器       合肥华泰医疗设备有限公司

2.4  生物安全柜（Class 2 Type B2型）  北京东联哈尔仪器制造有限公司

2.5  旋涡混合器                     上海琪特分析仪器有限公司

2.6  HZQ-Q全温振荡器               哈尔滨东联电子设备有限公司

2.7  旋转蒸干仪                     上海比朗仪器有限公司

2.8  高速离心机                     北京医用离心机厂

2.9  玻璃纤维滤纸                   英国Whatman公司

2.10  QF-3800氮气吹干仪            天津市东康科技有限公司

2.11  呕吐毒素总量免疫亲和柱       北京中检维康技术有限公司

2.12  10 mL玻璃注射器

2.13  泵流操作架                     北京中检维康技术有限公司

2.14  高效液相色谱仪LC-10AT         日本岛津公司

2.15  SPD-20A紫外检测器             日本岛津公司

2.16  色谱柱：Dikma C₁₈柱（柱长150 mm，内径4.6 mm，填料直径5 μm）

2.17  HPLC ChemStation软件系统       杭州普惠科技有限公司

2.18  100 μL微量注射器

2.19  500 mL三角瓶

2.20  250 mL三角瓶

2.21  5mL离心管

2.22  10 mL 玻璃试管

三、试剂和溶液 

除非另有规定，仅使用分析纯试剂、去离子水。

3.1  pH7.0 PBS缓冲液：称取8.0 g氯化钠，1.2 g磷酸氢二钠，0.2 g磷酸二氢钾，0.2 g氯化钾，用990 mL纯水溶解，然后用盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000 mL。

3.2  甲醇：色谱纯。

3.3  LB培养基：（每升）为蛋白胨10 g，氯化钠10 g，酵母浸粉5 g，pH值调整到7.0。高压灭菌20 min。

3.4  乙腈-水（10+90）：取10mL色谱纯乙腈加90mL双蒸水。

3.5  呕吐毒素标准品（10 mg/mL，5 mg/mL，2 mg/mL，1mg/mL）（Sigma）。

四、试样制备 

4.1 固体样品

呕吐毒素生物降解剂（固体邦霉解），按GB/T14699.1的规定进行采样，选取有代表性样品。

4.2 液体样品

呕吐毒素生物降解剂（液体邦霉解），按GB/T14699.1的规定进行采样，选取有代表性样品。 

4.3 霉变样品

有高浓度呕吐毒素的饲料或饲料原料，按GB/T14699.1的规定进行采样，选取有代表性样品。

五、分析步骤

5.1 饲料或饲料原料中DON提取

5.1.1

取一个500 mL三角瓶，瓶中称50 g霉变小麦，加200 mL甲醇，摇床震荡提取2小时，定性滤纸过滤，将滤液混合均匀。

5.1.2

取一个250 mL三角瓶，瓶中称25g霉变小麦，加100 mL蒸馏水，摇床震荡提取2小时，滤纸过滤，将滤液混合均匀。

5.2 饲料或饲料原料提取液中DON测定

5.2.1 净化

将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取5.2.2滤液0.5mL（V₁），注入免疫亲和柱中。使溶液以约1 mL/min左右的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。加入5 mLPBS缓冲液，5 mL双蒸水洗涤，调节流速为3 mL/min左右，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液。

5.2.2 洗脱

最后准确加入0.5 mL（V₂）色谱纯甲醇，孵育2 min，流速为1 mL/min左右，收集洗脱液于10 mL玻璃试管中，50℃氮气吹干，用0.1mL流动相溶解（相当于浓缩了5倍，T₁），用于HPLC分析。

5.3 降解反应

5.3.1 反应体系

（根据第5.3步中测得毒素含量来确定需要旋干的提取液的量，使旋干后加入LB培养基或ANSB714种子液后反应体系DON终浓度约为5ppm左右）取第5.2.1步中滤液20mL于150 mL脂肪瓶中，65℃旋干（无法完全旋干，仍有少量液体残留），加10mLLB培养基溶解作为对照组；加10 mL ANSB714种子液溶解作为处理组。

5.3.2 反应条件

用封瓶膜封口，于37℃，200转/min摇床中暗处反应。

5.4 检测方法

5.4.1 取样

分别于反应0h和48h时，分别取对照组和处理组液体各0.5mL（V₃）于5mL离心管中。

5.4.2 样品前处理

于5mL离心管中再加1mL（V₄）双蒸水，终止反应，10000转离心5min，取上清0.5 mL（V₅）过DON免疫亲和柱。

5.4.3 净化

将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，将空气压力泵与注射器相连接，加入5 mL PBS缓冲液，5 mL双蒸水洗涤，调节流速为3 mL/min左右，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液。

5.4.4 洗脱

最后准确加入0.5 mL（V₆）色谱纯甲醇，孵育2 min，流速为1 mL/min左右，收集洗脱液于10 mL玻璃试管中，50℃氮气吹干，用0.1mL流动相溶解（相当于浓缩了5倍，T₂），用于HPLC分析。

5.4.5 呕吐毒素标准工作液制备

根据使用需要，准确吸取一定量的呕吐毒素标准贮备液，用流动相稀释，分别配成系列浓度的标准工作液， 如DON浓度分别为10 mg/mL，5 mg/mL，2 mg/mL，1mg/mL，-20℃保存。

5.4.6 标准曲线的测定

以呕吐毒素标准工作液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准曲线对试样进行定量。

5.5 色谱条件

色谱柱：Dikma C₁₈ 色谱柱，4.6 mm×150 mm，5 μm；

流动相：乙腈：水=10:90；

流速：1 mL/min；

紫外检测器波长：218 nm；

进样量：20 μL；

呕吐毒素出峰时间：8-9 min。

5.6 结果计算

①根据绘制的标准工作曲线对检测样品中呕吐毒素浓度进行定量

标准曲线公式：Y=aX+b

X：检测样品的呕吐毒素浓度

Y：检测样品峰面积

②饲料或饲料原料提取液中DON的含量C_T

Y_T：上机测定样品的峰面积；

T₁：上机前样品氮气吹干浓缩的倍数；

V₂：用色谱纯甲醇洗脱的总体积（mL）；

V₁：过免疫亲和柱的样品的上柱体积（mL）；

③ANSB714种子液对饲料或饲料原料提取液中DON的降解率P

T：所取的0.5mL反应液在处理过程中的稀释倍数；

T₂：上机前样品用氮气吹干浓缩的倍数；

V₆：用色谱纯甲醇洗脱的总体积（0.5mL）；

V₅：吸取上清过免疫亲和柱的体积（mL）；

V₃：吸取各组反应液的体积（0.5mL）；

V₄：终止反应所用双蒸水的体积（1mL）；

P：ANSB714种子液对饲料或饲料原料提取液中DON的降解率（%）；

C₄₈：48h处理组反应液中DON浓度（μg/mL）；

C₀：0h对照组反应液中DON浓度（μg/mL）；

X₄₈：48h处理组样品上机测定的DON浓度（μg/mL）；

X₀：0h对照组样品上机测定的DON浓度（μg/mL）；

T：所取的0.5mL反应液在处理过程中的稀释倍数；

④ANSB714种子液对饲料或饲料原料提取液中DON的降解量M

M=C₀-C₄₈=(X_0－X₄₈)×T

M：ANSB714种子液对饲料或饲料原料提取液中DON的降解量（μg/mL）；

C₀：0h对照组反应液中DON浓度（μg/mL）；

C₄₈：48h处理组反应液中DON浓度（μg/mL）；

X₀：0h对照组样品上机测定的DON浓度（μg/mL）；

X₄₈：48h处理组样品上机测定的DON浓度（μg/mL）；

T：取样的0.5mL反应液在处理过程中的稀释倍数；

⑤结果表示与重复性

两个平行试样的测定结果使用算术平均数表示。同一试样两个平行测定值的相对偏差小于10%。