邦霉解对采食玉米赤霉烯酮污染日粮青年母猪的作用效果

 

1 前言

在高温低湿环境下，玉米、高粱、小麦等谷类作物易霉变产生ZEA。ZEA霉变的饲料被动物采食后，ZEA可经代谢沉积于肉、蛋、奶等动物产品中，严重威胁畜禽健康和人类食品安全。在所有动物中猪对ZEA的雌激素效应最为敏感，其典型的中毒症状为阴户肿大、阴道和直肠脱垂以及乳腺增大，同时ZEA也可引起母猪发生不孕、流产和假发情等繁殖障碍。此外，ZEA还具有肝毒性、免疫毒性、细胞毒性以及遗传毒性，对动物肿瘤的发生也具有一定影响。

目前，已报道的大多数能够降解ZEA的微生物均不能直接添加到饲料中，且没有对这些菌株在动物霉变饲料中的应用效果进行研究。本课题组分离得到的能够降解ZEA的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ANSB01G，在液体培养基以及自然霉变玉米、DDGS和猪全价配合饲料中对ZEA的降解率分别为88.65%、84.58%、66.34以及83.04%。该株菌已经保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.4297。同时，该菌株已获国家发明专利。北京世纪鸿邦生物科技有限公司结合计成课题组此前对黄曲霉毒素和呕吐毒素降解的研究，并复配免疫增强剂和自由基清除剂，推出邦霉解产品。可针对性地降解饲料中的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素，并可保护肝肾，提高动物的免疫力。本试验将进一步验证邦霉解在动物生产中的实际应用效果。将邦霉解添加到采食ZEA自然霉变的青年母猪日粮中，观察青年母猪的ZEA中毒症状，以及邦霉解对青年母猪ZEA中毒症状的缓解作用，为实际生产中邦霉解的应用及饲料ZEA污染的防控提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 ZEA污染的饲料原料

ZEA污染的自然霉变玉米：各饲料原料供给厂供给的玉米样本，经毒素检测分析，选取一种仅被ZEA污染的霉变玉米，其中ZEA含量为445.55μg/kg，黄曲霉毒素、呕吐毒素、赭曲霉毒素均为未检出。

2.2 试验动物与管理

试验选用平均体重为36.64±1.52 kg的杜×长×大三元杂交青年母猪18头，分为3个处理组，每个处理6个重复，每个重复1头猪，各处理间初始体重差异不显著（P>0.05）。试验开始前全猪舍清扫并消毒，试验期间每天清粪后消毒，单笼饲养，猪只自由采食和饮水。试验期24天。

2.3 试验设计与试验日粮

试验分为三个处理，其中对照组（C）饲喂正常玉米型日粮，处理组1（T1）饲喂霉变玉米型日粮（使用等量霉变玉米全部替换对照组的正常玉米型日粮中的玉米），处理组2（T2）日粮为在T1组的日粮中添加2 kg/T的邦霉解，T1和T2组日粮中ZEA的含量实测值为238.57±1.51 μg/kg。具体试验设计见表2-1。试验日粮参照NRC（1998）推荐标准一次性配制，在试验前取样，分析日粮中的营养成分含量和毒素水平。基础日粮配方及营养水平见表2-2。

表2-1 试验设计

Table 2-1 Experimental design

注：霉变玉米为被ZEA污染的玉米，经测定其ZEA含量为445.55μg/kg，黄曲霉毒素、呕吐毒素和赭曲霉毒素均未检出,T1、T2组日粮ZEA含量为238.57±1.51 μg/kg，黄曲霉毒素、呕吐毒素和赭曲霉毒素均未检出。

表2-2 基础日粮配方及营养水平（风干基础）

Table 2-2 Composition and nutrient levels of basal diets （Air-dry basis）

原料	原料配比（%）	营养水平	含量
玉米	50.00	猪消化能，MJ/kg	12.7820
小麦	8.57	粗蛋白质，%	17.1968
次粉	6.00	赖氨酸，%	1.0471
小麦麸	5.00	蛋氨酸，%	0.2618
去皮豆粕	5.00	蛋胱氨酸，%	0.5617
玉米胚芽粕	3.00	苏氨酸，%	0.7177
花生仁粕	5.00	色氨酸，%	0.1570
65赖氨酸	0.70	缬氨酸，%	0.6195
棉籽粕	6.00	钙，%	0.6131
DDGS	7.00	总磷，%	0.5642
1%猪预混料1	1.00	非植酸磷，%	0.3355
石粉	0.80	钠，%	0.2108
磷酸氢钙	1.00	氯，%	0.3620
大豆油	0.50	食盐，%	0.2980
食盐	0.30
四种小麦酶混合	0.01
苏氨酸	0.12

¹每千克提供：VA 16500 IU; VD₃ 2500 IU; VE 18 IU; VK₃ 2.3 mg; VB₁ 3.1 mg; VB₅ 12 mg; 烟酸 27 mg; 叶酸 0.5 mg; VH 0.1 mg; VB₁₂ 0.02 mg; VB₂ 5.5 mg; VB₆ 3.3 mg; 铜 70 mg，铁 170 mg; 锰 30 mg; 锌 145 mg; 硒 0.41 mg; 钴 0.07 mg; 碘 0.27 mg

2.4 测定指标及方法

2.4.1 生产性能测定

试验0、3、10、17 和 24 d对猪进行称重，并记录采食量和剩料量。根据以上数据计算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和饲料转化率（FCR，平均日采食量（g）/平均日增重（g））。每天观察猪只的采食情况及腹泻情况。

2.4.2 阴户面积测量与计算

试验开始后每天观察并记录猪只阴户红肿情况，并于试验0、3、10、17 和 24 d用游标卡尺测量阴户长（a）、宽（b），并计算阴户表面积。母猪阴户面积观察近似呈椭圆形，如图2-1所示，面积计算公式S=（π×a×b）/4。用阴户面积大小比较各组猪只的阴户肿大及恢复效果。

图2-1 猪外阴大小测量与计算

Figure 2-1 Measurement and calculation of vulva size

2.4.3 屠宰试验及样品采集

试验结束前12 h，所有猪空腹，然后屠宰。于屠宰前进行耳缘静脉采血，分离出血清，放入-20℃的冰箱保存。用于检测血清中雌二醇（E2），促卵泡激素（FSH），促黄体素（LH）和 催乳素（PRL）。

屠宰后剥离心脏、肝脏、肾脏、脾脏以及生殖器官（阴道+子宫角+卵巢）并称重，计算器官指数，研究邦霉解对采食ZEA青年母猪器官发育的影响。

器官指数＝器官重量（g）/活体重量（kg）

取子宫、卵巢及肝脏相同部位组织块， 组织大小约1.5 cm×1.5 cm ×0.3 cm，样品迅速浸入10%福尔马林固定液中固定，待做组织切片。

2.4.4 血清激素水平测定

    免疫法（RIA）测定生殖激素：E2、FSH、LH和PRL。血清样品首先根据放射免疫试剂盒（北京科美生物技术有限公司）的使用说明用放射性进行处理。然后再使用GC-1200放射免疫γ计数器（科大创新股份有限公司）进行激素浓度测定。

2.4.5 组织器官形态学观察

取10%福尔马林固定液固定的各组织标本，经乙醇逐级脱水，二甲苯透明，再经过包埋机浸蜡、包埋等处理后，使用切片机（德国莱卡RM2015）进行切片（5 μm），经H& E染色，然后在400×放大倍数下使用光学显微镜（Carl Zeiss, Germany）观察。

2.4.6 肝脏中ZEA及其代谢物残留量检测

肝脏中的ZEA及其代谢物（α-ZAL, β-ZAL, α-ZOL, β-ZOL和ZAN）的检测参考Duca等（2008）的检测方法，并进行部分修改。

实验步骤如下：

（1）将肝脏组织样磨碎，取5 g充分磨碎的样品，与10 mL的乙酸钠缓冲液（50 mM，pH 4.8）和80 μL β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯复合酶充分混合，37℃孵化15h；

（2）孵化完毕后，使用冰醋酸调节pH至4.0；

（3）加入10 mL乙腈和200 μL 1 M NaOH溶液，然后与200 r/min摇床中振荡60 min；

（4）5000 rpm离心10 min，量取上清液10 mL，用40 mL pH 7.4 的PBS溶液稀释，混匀，并用定性滤纸过滤；

（5）取上述滤液40 mL，以1滴/秒的流速全部通过ZEA及其代谢物的免疫亲和柱，直至空气流经亲合柱，然后用10.0 mL蒸馏水以1～2滴/秒的流速淋洗亲和柱，直至空气流经亲合柱；

（6） 将试管置于亲和柱下，然后使用2 mL甲醇以1滴/秒的速度淋洗亲和柱，将所有的样品淋洗液收集于试管中，然后使用氮吹仪吹干，最后用200 μL甲醇溶解用于HPLC上机检测。

2.5数据统计及分析

用SAS 9.0软件的GLM程序对试验数据进行统计分析，以P＜0.05为显著水平，方差分析结果显著时进行多重比较，结果用平均值±标准误表示。

3 结果

3.1 邦霉解对饲喂ZEA污染日粮青年母猪生长性能的影响

表2-3结果显示，24d的试验结束后，3个处理组之间的猪平均日增重、平均日采食量和饲料转化率均没有出现显著差异（P>0.05）。说明ZEA含量为238.57 μg/kg的自然霉变日粮对青年母猪生长性能没有显著的影响。

 

表2-3邦霉解对饲喂ZEA污染日粮青年母猪生产性能的影响

Table 2-3 Effects of MLJ on growing performance of prepubertal female gilts when exposed to ZEA

3.2 邦霉解对饲喂ZEA污染日粮青年母猪阴户面积和器官指数的影响

由图2-2可知，试验0-3 d各组间青年母猪阴户面积均没有出现显著差异（P＞0.05），且没有出现明显的红肿现象。试验3-10 d，T1和T2两个处理组中猪阴户面积大小水平相同，均明显高于对照组，并且出现红肿症状。试验10-17 d，T2处理组中青年母猪的阴户面积逐渐恢复至正常对照组水平，红肿症状逐渐消失，而T1处理组中青年母猪的阴户面积始终大于对照组，且阴户红肿症状越来越严重。试验17-24 d，T1组中猪的阴户面积仍然高于对照组和T2组的猪的阴户面积，且红肿现象仍未消失（图2-3），而T2组与对照组的猪阴户面积趋于一致。

图2-2 邦霉解对饲喂ZEA污染日粮青年母猪阴户面积（mm²）的影响

Figure 2-2 Effects of MLJ on vulva sizes of prepubertal female gilts when exposed to ZEA  

图2-3 邦霉解对饲喂ZEA污染日粮青年母猪外阴的影响

Figure 2-3Effects of MLJ on vulva of prepubertal female gilts when exposed to ZEA

由表2-4结果可知，与对照组C相比，T1组（ZEA含量为238.57 μg/kg）青年母猪心脏、肝脏、脾脏和肾脏指数没有显著改变，但是生殖器官（阴道+子宫角+卵巢）指数显著增加（P<0.05）。而在T1组日粮基础上添加邦霉解（T2组）显著降低了生殖器官指数，改善了ZEA引起的生殖器官肿大症状，达到正常对照组水平。

 

表2-4邦霉解对饲喂ZEA污染日粮青年母猪器官指数的影响

Table 2-4 Effects of MLJ on relative weights of organs of prepubertal female gilts when exposed to ZEA

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），下表同。

In the same row, values within the same colume with different small letters are significantly different （P<0.05）. The same as below.

 

3.3 邦霉解对饲喂ZEA污染日粮青年母猪血清激素的影响

表2-5结果显示，处理组T1、T2与对照组C相比，血清中FSH、LH和E2水平没有显著差异（P>0.05）。而T1组中血清PRL 水平显著高于对照组（P < 0.05），在T1组基础上添加邦霉解（T2），可以维持血清PRL水平达到正常对照组水平。。

表2-5邦霉解对饲喂ZEA污染日粮青年母猪血清雌激素的影响

Table 2-5 Effects of MLJ on serum hormones of prepubertal female gilts when exposed to ZEA

组别	促卵泡激素（FSH） mIU/ml	促黄体素（LH） mIU/ml	雌二醇 （E2）  pg/ml	催乳素（PRL） uIU/ml
C	2.17±0.17	22.82±2.44	27.63±3.75	135.15±5.15a
T1	1.80±0.05	18.65±0.26	25.55±2.51	168.37±1.89b
T2	2.22±0.14	20.50±3.30	26.97±1.36	147.96±7.97a

3.4 邦霉解对饲喂ZEA污染日粮青年母猪组织形态学的影响

在进行屠宰试验时，对子宫、卵巢和肝脏进行的临床观察，没有发现明显的病变。通过对各组织进行病理学组织切片分析（图2-4）发现，T1组中子宫体细胞出现细胞肿大和脂肪变性；卵巢中卵泡出现萎缩退化，内部空化；同时，肝脏中肝细胞出现细胞肿胀、细胞炎症和淋巴浸润现象。然而，添加邦霉解的T2组中，子宫、卵巢和肝脏中出现的细胞病变比例明显减少，细胞损伤情况减轻，各组织细胞形态接近对照组C水平。

图2-4 不同处理组中子宫、卵巢和肝脏组织病理学切片

Figure 2-4 Photomicrographs （optical microscopy） of H&E stained uterus, ovaries, and liver sections from different treatments

3.5 肝脏中ZEA及其代谢物的残留

对肝脏中ZEA及其代谢物（α-ZAL, β-ZAL, α-ZOL, β-ZOL和ZAN）残留的检测发现，各个处理组中均没有检测到ZEA及其代谢物的残留。

4 讨论

ZEA是一种真菌代谢产生的雌激素类真菌毒素，其对动物的主要作用效应表现为对动物外周生殖器官的影响。猪采食ZEA污染的日粮后产生的ZEA中毒的临床症状主要为阴户湿肿、有时出现阴道和直肠脱垂以及乳腺增大。ZEA中毒还可导致母猪出现假发情、不孕和流产等繁殖障碍。目前，霉菌毒素吸附剂被广泛用于饲料中解决霉菌毒素污染问题。但是，大多数试验证实吸附剂仅对饲料黄曲霉毒素有明显效果，而对其他种类毒素吸附效果不明显，同时吸附剂最终又将饲料中的霉菌毒素转移到了环境中，给环境造成二次污染。因此，吸附剂无法解决饲料ZEA污染问题。众所周知，霉菌毒素生物降解是一种效率高、特异性强、对饲料和环境无污染的去毒方法，因此，用微生物降解饲料中的ZEA成为了现在目前霉菌毒素解毒去毒研究的热点。

目前还没有关于降解ZEA的枯草芽孢杆菌在动物饲料中应用的相关报道。试验证实，邦霉解对自然霉变玉米、DDGS和猪全价配合饲料中ZEA的降解率分别为84.58%、66.34以及83.04%。邦霉解除对ZEA具有良好的降解活性之外，还能抑制病原菌微生物的生长，对加热、模拟胃液和模拟胆盐均有很好的耐受性。同时，对菌株降解ZEA特性和降解机制的研究结果表明，邦霉解对饲料和饲料原料中ZEA的去除是生物降解，而不是吸附。

本试验研究了邦霉解对采食ZEA污染日粮青年母猪的作用效果。试验结果表明，日粮中ZEA含量为238.57 μg/kg时，对青年母猪的生长性能没有产生显著的影响。这与其他研究者的研究结果一致。Jiang等（2010）在35头体重为12.36±1.46 kg的杜×长×大断奶母仔猪日粮中添加1 mg/kg 的ZEA，饲喂24 d后，仔猪生长性能没有出现显著差异。同时，Jiang等（2012）在21日龄的体重为8.84±0.21 kg的36头杜×长×大断奶仔猪（公母各半）日粮中添加1.05 mg/kg 的ZEA，饲喂22 d后，仔猪生长性能也没有出现显著差异。Rainey等报道，约克夏仔猪连续饲喂含2.0 mg/kg ZEA纯品的日粮两周，仔猪的体重没有出现显著的影响。

猪ZEA中毒最明显的临床症状是阴户红肿、直肠和阴道脱垂。仔猪日粮中添加0.75 mg/kg ZEA，7天即可导致阴户红肿，21天时，其阴户面积、生殖道增重显著高于对照组猪。Andretta等报道，在断奶雌性仔猪日粮中添加2 mg/kg ZEA，饲喂28天后，雌性仔猪的生殖道长度和重量都显著增加，并且其阴户体积增大为正常对照组的8.2倍。Jiang等（2011）研究发现，在仔猪日粮中添加1.1 mg/kg，2.0 mg/kg和3.2 mg/kg 的ZEA纯品，饲喂18 d，仔猪出现明显的阴户红肿症状，且阴户面积随ZEA浓度增高而增大，其阴户长、宽、高和面积水平均显著高于正常对照组。本试验结果发现，青年母猪日粮中ZEA含量为238.57 μg/kg时即可导致青年母猪的阴户红肿，同时导致生殖器官指数显著增加；而在ZEA霉变日粮中添加邦霉解，能显著改善青年母猪阴户红肿症状和生殖器官指数的增加，使其达到正常对照组水平。

已有大量研究报道，ZEA可与雌激素受体结合，从而导致动物出现雌激素过多症状。Diekman和Long发现，仔猪日粮中添加ZEA纯品能够导致仔猪LH分泌量减少，但是对FSH的水平没有显著影响。Wang等报道，日粮中添加ZEA能使仔猪的E2和LH水平降低，但是对FSH 水平没有显著影响。同时，Jiang等（2012）也报道，断奶仔猪采食ZEA含量为1.05 mg/kg的日粮，22 d后血清中E2含量显著降低。本试验结果显示，青年母猪采食ZEA污染的日粮可导致血清中PRL水平增加，但是对FSH、LH和E2水平没有显著影响。而在ZEA污染日粮中添加邦霉解，能使血清中PRL维持正常水平。

研究报道，ZEA能够加强细胞的增值，导致子宫细胞增生、子宫颈和阴道细胞的组织变形。Zwierzchowski等报道，仔猪饲喂200 μg/kg·bw的ZEA可通过激活成熟卵泡粒层细胞的凋亡过程，干扰卵泡的成熟和发育过程。Maaroufi等报道，ZEA及其某些代谢物能够与肝脏细胞结合，导致肝细胞溶解。本试验对子宫、卵巢和肝脏组织病理学检查发现，青年母猪采食ZEA污染的日粮导致子宫体细胞出现细胞肿大和脂肪变性；卵巢中卵泡出现萎缩退化，内部空化；以及肝脏中肝细胞出现细胞肿胀、细胞炎症和淋巴浸润现象，这些症状与上述研究结果相似。而在ZEA污染日粮中添加邦霉解，显著减轻了ZEA对青年母猪子宫体细胞、卵泡和肝脏细胞的损伤程度，使之接近正常对照组的状态。

5 结论

5.1 日粮中含有238.57μg/kg的ZEA即可导致青年母猪出现阴户肿胀，生殖器官指数增加；在ZEA污染日粮中添加邦霉解可以显著缓解这些中毒症状。

5.2 青年母猪采食ZEA污染的日粮可导致血清中PRL水平增加，但是对FSH、LH和E2水平没有显著影响；而在ZEA污染日粮中添加邦霉解能使血清中PRL维持正常水平。

5.3 青年母猪采食ZEA污染的日粮可导致子宫、卵巢和肝脏出现不同程度的细胞损伤；而在ZEA污染日粮中添加邦霉解缓解了ZEA对组织细胞的损伤程度。