仿生法测定邦霉解对饲料中三种毒素的降解率
来源: | 作者:北京世纪鸿邦生物科技有限公司技术部 | 发布时间: 2019-11-09 | 201 次浏览 | 分享到:

一、试验材料:

1. 霉变花生粕、霉变DDGS、邦霉解

2. 酸性外源酶混悬液:酸性蛋白酶(50 000 U/g)、淀粉酶(≥7 000 U/g)、果胶酶(≥30 000 U/g)、纤维素酶(≥20 000 U/g)、甘露聚糖酶(≥50 000 U/g)、木聚糖酶(≥20 000 U/g)、脂肪酶(100 000 U/g)。现配先用,用前摇匀。

3. 肠道外源酶混悬液:中性蛋白酶(100 000 U/g)、碱性蛋白酶(200 000 U/g)、淀粉酶(≥7 000 U/g)、果胶酶(≥30 000 U/g)、纤维素酶(≥20 000 U/g)、甘露聚糖酶(≥50 000 U/g)、木聚糖酶(≥20 000 U/g)、脂肪酶(100 000 U/g)。现配先用,用前摇匀

4. 磷酸缓冲液(0.1 MpH 6.0):49.5 mL 0.2 M Na2HPO4溶液(0.2 M Na2HPO4溶液含Na2HPO4·2H2O 35.61 g/L或含Na2HPO4·12H2O 71.64  g/L)和50.5 mL 0.2 M NaH2PO4溶液(0.2 M NaH2PO4溶液含NaH2PO4·H2O 27.6 g/L或含NaH2PO4·2H2O 31.21 g/L),混合均匀        

5. 0.2 M HCl溶液                                          

6. 1 M HCl溶液

7. 1 M NaOH溶液

8. LB培养基:每升水中加10 g NaCl,胰蛋白10 g,酵母提取物5 g

二、试验设计

采用邦霉解仿生评价体系(胃内消化2 h,肠道内消化4 h),评价邦霉解对三种毒素的降解率。试验分为2组。

对照组:霉变饲料胃消化2 hà小肠消化4 h(混合酶)à测三种毒素的含量(瓶12);

处理组:霉变饲料加邦霉解胃消化2 hà小肠消化4 h(混合酶)à测三种毒素的含量得出降解率(瓶34)。

三、试验方法

1. 对照组:霉变饲料中毒素含量的测定(降解前):

胃消化:准确称取霉变饲料各5 g,分别加入到两个锥形瓶中(12),再各加入19 mL磷酸缓冲液(0.1 MpH6.0),再加10 mL 0.2 M HCl,用1 M HCl1 M NaOH溶液调pH3.0,加1 mL新鲜配制的酸性外源酶混悬液(酸性蛋白酶0.5 g,其他酶各0.1 g溶于10 mL PBS中)混匀,用parafilm封口,于37℃恒温摇床培养2 h 150 r/min)。

肠消化:再加入5 mL 0.6 M NaOH溶液,用1 M HCl1 M NaOHpH调到6.8后加入10 mL新鲜配制的肠道外源酶液(中性蛋白酶0.4 g,其他酶各0.1 g溶于50 mL PBS)用parafilm封口,于37恒温摇床消化4 h150 r/min)。

培养结束后,测定黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮时,各锥形瓶中加入180 mL甲醇;测定呕吐毒素时,各锥形瓶中加入180 mL蒸馏水(稀释了45倍),摇床振荡萃取2 h,定性滤纸过滤,将滤液混合均匀,分别取滤液10 mL于两个100 mL三角瓶中,分别加40 mL pH 7.0 PBS(再次稀释5倍),混合均匀。然后分别取10 mL稀释液与玻璃注射器中上柱(1mL/min),用10 mL的双蒸水淋洗2次(3 mL/min)。最后用0.5 mL的色谱级甲醇洗脱免疫亲和柱2次(浓缩10倍),收集洗脱液与两个5 mL棕色小瓶中,记作12。用HPLC分析三种毒素的含量(最终稀释了23倍)。

2. 处理组:降解后三种毒素含量的测定:

胃消化:准确称取霉变饲料各5 g和邦霉解各0.2 g,分别加入两个锥形瓶中(34),再各加入19 mL磷酸缓冲液(0.1 MpH 6.0),再加10 mL 0.2 M HCl,用1 M HCl1 M NaOH溶液调pH3.0,加1 mL新鲜配制的酸性外源酶混悬液(酸性蛋白酶0.5 g,其他酶各0.1 g溶于10 mL PBS中)混匀,用parafilm封口,于37℃恒温摇床培养2 h 150 r/min)。

肠消化:再加入5 mL 0.6 M NaOH溶液,用1 M HCl1 M NaOHpH调到6.8后加入10 mL新鲜配制的肠道外源酶液(中性蛋白酶0.4 g,其他酶各0.1 g溶于50 mL PBS)和用parafilm封口,于37℃恒温摇床消化4 h150 r/min)。

培养结束后,测定黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮时,各锥形瓶中加入180 mL甲醇;测定呕吐毒素时,各锥形瓶中加入180 mL蒸馏水(稀释了45倍)摇床振荡萃取2 h,定性滤纸过滤,将滤液混合均匀,分别取滤液10 mL于两个100 mL三角瓶中,分别加40 mL pH7.0 PBS,混合均匀。然后分别取10 mL稀释液与玻璃注射器中上柱(1 mL/min),用10 mL的双蒸水淋洗2次(3 mL/min)。最后用0.5 mL的色谱级甲醇洗脱免疫亲和柱2次(浓缩10倍),收集洗脱液与两个5mL棕色小瓶中,记作34。用HPLC分析三种毒素的含量。

四、试验结果

组别

样品

毒素含量(ppb

降解率(%

黄曲霉毒素

 

 

对照组

花生粕1

25.6

 

 

花生粕2

23.4

 

处理组

花生粕1+邦霉解

5.3

79.3%

 

花生粕2+邦霉解

6.5

72.2%

玉米赤霉烯酮

 

 

 

对照组

DDGS 1

376.4

 

 

DDGS 2

366.9

 

处理组

DDGS 1+邦霉解

63.2

83.2%

 

DDGS 2+邦霉解

58.7

84.0%

呕吐毒素

 

 

 

对照组

DDGS 1

862.1

 

 

DDGS 2

849.6

 

处理组

DDGS 1+邦霉解

286.6

66.8%

 

DDGS 2+邦霉解

308.6

63.7%

1邦霉解仿生法测定饲料中三种毒素的降解率结果