邦霉解ANSB060降解剂对 采食黄曲霉毒素污染日粮肉鸡的作用效果
来源: | 作者:中国农业大学 动物营养与饲料安全实验室 | 发布时间: 2019-11-09 | 165 次浏览 | 分享到:

前言

饲料原料(如玉米、花生和小麦等)在收获、运输、贮存和加工等过程中容易被霉菌污染,当环境温度湿度较高、饲料原料水分含量较大时,霉菌开始大量繁殖并产生霉菌毒素。黄曲霉毒素(AF)由于其强烈的致癌、致畸、致突变和免疫抑制作用,对动物和人类的健康造成了严重的威胁。AF被动物采食后,代谢的主要部位是肝脏,因此肝脏受损伤的程度最大。动物长期摄入AF,可导致其肝脏细胞受损、组织形态异常和肝脏功能下降等。有研究报道表明,AF可引起大鼠肝脏脂质过氧化,从而造成肝细胞膜损伤。Özen等发现,AFB1可升高肉鸡肝脏丙二醛水平,导致肝细胞空泡变性、坏死和胆管增生。此外,AF可残留在动物产品(如肉、蛋、奶等)中,而威胁人类的健康。

因此,如何有效地降低和消除AF的污染成为众多研究者关注的热点。目前,去除粮食和饲料中AF的方法主要有物理、化学和微生物法。其中,微生物降解法具有解毒彻底、专一性强,对饲料无污染,不影响饲料的营养价值,而且能够避免毒素的重新产生等优点,从而备受研究者的关注。有很多微生物都被报道具有降解AF的作用,例如黑曲霉(A. niger)、诺卡氏菌(N. asteroides)、红串红球菌(R. erythropolis)和分支杆菌(M. fluoranthenivorans)等。但是,关于它们在动物体内降解黄曲霉毒素效率和应用效果的研究却少有报道。

本课题组从鱼肠道内容物中筛选出一株可同时降解AFB1AFM1以及AFG1的枯草芽孢杆菌,命名邦霉解ANSB060。该菌株具有良好的抗逆性,芽孢存活率高,可抗胃酸耐胆盐。另外作为益生菌,该菌可显著抑制大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌的生长,还可有效提高肉鸡的生长性能。并且枯草芽孢杆菌通过美国食品和药物管理局(FDA)、美国饲料管理监管协会(AAFCO)和中国农业部的认可,可直接添加到饲料中。因此,该菌株在动物饲料霉菌毒素生物降解剂的开发中具有广阔的发展前景。

2 材料与方法

2.1 试验材料

邦霉解ANSB060(黄曲霉毒素降解菌株),主要成分为枯草芽孢杆菌,活菌数约为3×109 CFU/g

2.2 黄曲霉毒素污染的饲料

搜集来自于不同地区饲料原料测定样品中霉菌毒素的含量,包括AF、玉米赤霉烯酮(ZEA)、呕吐毒素(DON)和赭曲霉毒素AOTA),以期找到只含有AF的饲料原料。最终,找到一批主要被AF污染并且含量较高的霉变花生粕,样品中AFB1AFB2AFG1AFG2ZEA的含量分别为330.080.130.27.115.1 μg/kgDONOTA未被检出。

2.3 试验动物与饲养管理

饲养试验在中国农业大学河北涿州实验基地进行,试验选用360只体重接近的1日龄罗斯308肉公鸡,随机分为6个处理,每个处理6个重复,每个重复10只鸡,预饲期1周,此期间饲喂正常商品日粮,试验期5周。采用多层笼养,常规饲养管理,每天定时喂料三次,自由采食和饮水。饲养前3天,24 h光照,从第4天起,光照制度变为23L1D。饲养第一周,温度保持在30˚C;从第8天至24天,温度逐步降到21˚C;之后温度一直保持在21˚C。畜舍相对湿度为65%70%,采用纵向负压通风。免疫程序按常规进行。及时清理鸡粪,每天擦洗水料槽,保证鸡舍良好的卫生条件。

2.4 试验设计与试验日粮

试验分为6个处理,具体试验设计见表2-1C0组(正对照组)为正常玉米豆粕型基础日粮,含有21%正常花生粕,基础日粮配方及营养成分含量见表2-2C1.0组是在基础日粮中添加了1.0 kg/t的邦霉解ANSB060M0组(负对照组)是用21%的霉变花生粕替代基础日粮中等量的正常花生粕;M0.5M1.0M2.0组是在M0日粮中分别添加了0.51.02.0 kg/t的邦霉解ANSB060。试验期5周。在试验前多点多次取样,再次确定日粮中霉菌毒素的含量。C0C1.0组未检出霉菌毒素,M0M0.5M1.0M2.0组日粮中AFB1AFB2AFG1AFG2ZEA的平均含量分别为70.711.06.52.04.1 μg/kgDONOTA未被检出。

2-1 试验设计

Table 2-1 Experimental design

分组 Group

日粮 Ration

C0

21%正常花生粕的基础日粮(正对照)

C1.0

21%正常花生粕的基础日粮+1.0 kg/t邦霉解ANSB060

M0

21%霉变花生粕的基础日粮(负对照)

M0.5

21%霉变花生粕的基础日粮+0.5 kg/t邦霉解ANSB060

M1.0

21%霉变花生粕的基础日粮+1.0 kg/t邦霉解ANSB060

M2.0

21%霉变花生粕的基础日粮+2.0 kg/t邦霉解ANSB060

注:(1霉变花生粕为被AF污染的花生粕,经测定,其AFB1AFB2AFG1AFG2含量分别为330.080.130.27.1 µg/kg其他种类毒素ZEA15.1 µg/kg DONOTA均未检出。

2C0C1.0组日粮中霉菌毒素未被检出,M0M0.5M1.0M2.0组日粮中AFB1AFB2AFG1AFG2ZEA的平均含量分别为70.711.06.52.04.1 μg/kgDONOTA未被检出。

2-2 基础日粮组成及营养水平(风干基础)

Table 2-2 Composition and nutrient levels of basal diets (Air-dry basis)

原料

Ingredient

组成

Percentage (%)

营养成分

Nutrition component

含量

Content

玉米

57.70

粗蛋白%

21.48

膨化大豆

6.00

代谢能MJ/kg

12.60

豆粕

8.20

%

0.99

花生粕

21.00

总磷%

0.65

石粉

1.37

非植酸磷%

0.43

磷酸氢钙

1.80

蛋氨酸%

0.62

食盐

0.30

+胱氨酸%

0.91

大豆油

2.00

赖氨酸%

1.15

赖氨酸[98.5%]

0.47

色氨酸%

0.21

DL-蛋氨酸

0.36

苏氨酸%

0.81

苏氨酸

0.19

 

 

复合多维1

0.03

 

 

氯化胆碱

0.10

 

 

肉鸡--微量2

0.30

 

 

沸石粉

0.18

 

 

总计

100.00

 

 

1每千克含:维生素A 12 000 IU,维生素D3 3 000 IU,维生素E 7.5 IU,维生素K 1.5 mg,硫胺素 0.6 mg,核黄素 4.8 mg,烟酸 10.5 mg,吡哆醇 1.8 mg,叶酸 150 μg,维生素B12 9 μg

2每千克含:泛酸钙 30 mg;锰 120 mg;碘 0.70 mg;铁 30 mg;铜 8 mg;锌 100 mg;硒 0.3 mg

2.5 测定指标及方法

2.5.1 样品采集及处理

在试验的第35天,每个重复随机挑选与平均体重接近的两只鸡,禁食12 h后,翅下采血,于4˚C 1 000× g离心10 min,分离出血清,放于-70˚C冰箱保存。用于检测血清生化指标和抗氧化指标。

鸡只被屠宰后剥离肝脏,迅速取肝脏组织(左叶尖端)用锡箔纸包裹,放入液氮中保存,用于检测肝脏抗氧化指标;另取肝脏组织(右叶尖端),用生理盐水冲净并用滤纸吸干水分,于10%福尔马林固定液中固定,用于组织切片观察。剩余肝脏保存于-20˚C冰箱,用于AF残留分析。

鸡只被屠宰后迅速剥离右侧胸肌,保存于-20˚C冰箱,用于AF残留分析。

每个重复另选取与平均体重接近的两只鸡,屠宰后,取十二指肠食糜,同一重复的两只鸡的食糜收集于同一管中,用于测定黄曲霉毒素的残留。

2.5.2 血清生化指标测定

血清中的总蛋白(TP)含量以及谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)活性均采用试剂盒测定,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。具体的测定方法参照试剂盒所提供的说明书。

2.5.3 血清及肝脏抗氧化指标测定

称取约0.5 g左右的肝脏样品,加入4.5 mL预冷的生理盐水,用组织匀浆机匀浆,制成10%的匀浆液。匀浆后于4˚C 1 200× g低温离心10 min,取上清液待用。

血清及肝脏中的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)含量均采用试剂盒测定,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。具体的测定方法参照试剂盒所提供的说明书。

2.5.4 组织器官形态观察

将固定的各组织标本经乙醇逐级脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋等处理后,用切片机(德国莱卡RM2015)切成5 μm的切片,经HE染色,然后在光学显微镜(Carl ZeissGermany)下观察。

2.5.5 肝脏和肌肉中AF残留量测定

肝脏和肌肉中AFB1AFB2AFG1AFG2AFM1的测定参考AOAC[179]的检测方法,并进行部分调整修改。

检测步骤如下:

1)分别将肝脏和肌肉组织匀浆,取25 g样品,加入5 g氯化钠和100 mL甲醇水(8020)溶液,高速匀浆3 min

2)滤纸过滤,取20 mL滤液,用80 mL含有0.1% Tween-20PBS缓冲液稀释,混匀,并用玻璃纤维滤纸过滤;

3)取上述滤液45 mL,以1/秒的流速全部通过黄曲霉毒素总量或AFM1的免疫亲和柱,直至空气流经亲和柱,然后用10 mL双蒸水以12/秒的流速淋洗亲和柱两次,直至空气流经亲和柱;

4)将玻璃试管置于亲和柱下,分两次各加入0.5 mL甲醇,分别孵育2 min,以1 mL/min左右的流速洗脱,收集洗脱液。然后50˚C氮气吹干,最后用150 μL流动相重溶,用于HPLC分析。

2.5.6 食糜中AF残留量测定

十二指肠食糜中AFB1AFB2AFG1AFG2的测定参考AOAC的检测方法,并进行部分调整修改。

检测步骤如下:

1)取0.5 g冻干食糜样品,加入4 mL甲醇水(8020)溶液,高速匀浆3 min

2)然后2 500× g离心5 min,取2 mL上清液,用8 mL PBS缓冲液稀释,混匀;

3)将上述液体以1/秒的流速全部通过黄曲霉毒素总量免疫亲和柱,直至空气流经亲和柱,然后用10 mL双蒸水以12/秒的流速淋洗亲和柱两次,直至空气流经亲和柱;

4)将试管置于亲和柱下,分两次各加入0.5 mL甲醇,分别孵育2 min,以1 mL/min左右的流速洗脱,收集洗脱液。然后50˚C氮气吹干,最后用100 μL流动相重溶,用于HPLC分析。

2.6 统计分析

根据完全随机试验设计,数据采用SAS 9.0软件中的GLM程序进行方差分析,P < 0.05为显著水平,检验差异显著者,采用Duncan’s进行多重比较。Contrast语句分析在霉变日粮中添加邦霉解ANSB060对测定指标的影响(M0 vs. M0.5+M1.0+M2.0);并对在霉变日粮中添加不同剂量的邦霉解ANSB06000.51.02.0 kg/t)进行线性和二次曲线分析。

3 结果

3.1邦霉解ANSB060对采食AF污染日粮肉鸡血清生化指标的影响

由表2-3可知,霉变日粮对肉鸡血清AST酶活有显著影响,与正对照C0组相比,M0组肉鸡血清AST活性升高37%C1.0组的AST活性与C0组差异不显著P > 0.05。在霉变日粮中加入邦霉解ANSB060可显著降低血清中AST含量P < 0.05,并且降低程度与邦霉解ANSB060添加剂量呈线性和二次曲线相关,M2.0AST活性显著低于负对照组,与正对照组差异不显著(P > 0.05)。其它测定指标各组间差异不显著P > 0.05

2-3 邦霉解ANSB060对采食AF污染日粮肉鸡血清生化指标的影响(n=12

Table 2-3 Effects of BMJ ANSB060 on serum biochemical parameters of broilers fed moldy peanut meal naturally contaminated with aflatoxins (n=12)

组别

Group

总蛋白

TPg/L

谷丙转氨酶

ALTU/L

谷草转氨酶*

ASTU/L

碱性磷酸酶

ALPU/L

C0

25.88

2.08

34.25b

1 419.5

C1.0

25.25

2.20

36.22ab

1 425.8

M0

23.87

1.97

47.14a

1 517.0

M0.5

23.67

2.19

48.29a

1 489.4

M1.0

23.94

2.03

41.45ab

1 440.4

M2.0

24.06

1.83

31.84b

1 437.6

SEM

0.968

0.423

0.853

49.291

P

 

 

 

 

F-test

0.524

0.99

<0.001

0.678

线性

0.876

0.766

<0.001

0.203

二次曲线

0.894

0.611

<0.001

0.803

注:同列数据不同小写字母表示差异显著(P < 0.05),下表同。*霉变日粮中不添加邦霉解ANSB060与添加邦霉解ANSB060的比较(M0 vs. M0.5+M1.0+M2.0)(ASTP < 0.01

3.2 邦霉解ANSB060对采食AF污染日粮肉鸡血清和肝脏抗氧化指标的影响

2-4显示,各处理组之间血清和肝脏SOD活性差异不显著P > 0.05M0组肉鸡的血清GSH-Px活性,与C0C1.0组相比,平均降低了7%。而在霉变花生粕日粮中添加邦霉解ANSB060可提高血清中GSH-Px活性,尤其在M2.0组中,肉鸡血清GSH-Px活性显著高于负对照组P < 0.05,并且与正对照组差异不显著P > 0.05。与C0C1.0组相比,M0组肉鸡的血清MDA含量平均升高了46%P < 0.05,在M0日粮中添加邦霉解ANSB060,可以显著降低MDA含量,并且添加剂量越多,降低程度越显著,M2.0组与正对照组差异不显著。与血清MDA含量变化趋势相同,M0组肝脏MDA含量与C0C1.0组相比,平均升高了18%P < 0.05;添加邦霉解ANSB060后,MDA含量显著下降,并且与添加剂量呈线性相关,M1.0M2.0组的MDA含量接近正对照组水平。在正常日粮中添加邦霉解ANSB060对肉鸡血清和肝脏抗氧化指标没有显著影响P > 0.05

3.3 邦霉解ANSB060对采食AF污染日粮肉鸡肝脏组织形态学的影响

由图2-1可见,与正对照组相比,采食M0日粮肉鸡的肝脏略微肿大且颜色苍白。C1.0组和C0组肉鸡的肝脏相似。在霉变花生粕日粮中添加邦霉解ANSB060可缓解肝脏形态的变化,并且缓解程度与邦霉解ANSB060的添加剂量相关。通过肝脏组织病理学切片(图2-2)分析可知,M0组的肉鸡肝脏损伤最严重,可见胆管增生、肝细胞空泡变性、肝细胞和汇管区淋巴细胞浸润。而添加邦霉解ANSB060后,肝脏细胞病变比例明显减少,细胞损伤情况减轻,尤其在M2.0组,肝脏损伤程度最轻。

2-4 邦霉解ANSB060对采食AF污染日粮肉鸡血清和肝脏抗氧化指标的影响(n=12

Table 2-4 Effects of BMJ ANSB060 on serum and liver antioxidant index of broilers fed moldy peanut meal naturally contaminated with aflatoxins (n=12)

组别

Group

血清Serum

肝脏Liver

SOD

U/mgprot

GSH-Px

U/mgprot

MDA*

nmol/mgprot

SOD*

U/mgprot

GSH-Px

U/mgprot

MDA*

nmol/mgprot

C0

119.33

491.62a

16.01c

297.15

72.483

0.218c

C1.0

116.01

492.04a

17.11c

296.83

72.339

0.225bc

M0

110.86

457.25c

24.21a

275.48

63.157

0.262a

M0.5

113.19

468.12bc

22.64a

293.11

67.315

0.245ab

M1.0

115.01

469.56bc

21.14ab

291.32

67.640

0.240abc

M2.0

117.75

479.75ab

18.63bc

293.66

71.783

0.227bc

SEM

2.943

6.686

1.025

6.899

2.589

0.008

P

 

 

 

 

 

 

F-test

0.404

0.005

<0.001

0.332

0.095

0.007

线性

0.093

0.027

0.001

0.106

0.031

0.004

二次曲线

0.943

0.960

0.656

0.280

0.997

0.824

注:*霉变日粮中不添加邦霉解ANSB060与添加邦霉解ANSB060的比较(M0 vs. M0.5+M1.0+M2.0)(血清MDAP = 0.009;肝脏SODP = 0.049;肝脏MDAP = 0.011)。

  

2-1 不同处理组肝脏照片

Figure 2-1 Representative livers of broilers from different groups




图2-2 不同处理组肝脏组织病理学切片(HE染色40×,比例尺=50 μm)

Figure 2-2 Representative photomicrographs (optical microscopy) of hematoxylin and eosin-stained broiler liver sections from different groups (scale bar=50 μm)

3.4 邦霉解ANSB060对采食AF污染日粮肉鸡肝脏、肌肉和十二指肠食糜中AF残留的影响

由表2-5可以看出,肉鸡肝脏中未检出AFG1AFG2,并且C0C1.0组肉鸡肝脏中也未检出AFB1AFB2AFM1。采食AF污染日粮的肉鸡肝脏中AFB1AFB2AFM1含量最高,分别为0.240.030.20 ng/g邦霉解ANSB060的添加可显著降低肝脏中AFB1AFB2AFM1的残留量P < 0.05。采食M0日粮肉鸡的肌肉中未检出AF

2-5 邦霉解ANSB060对采食AF污染日粮肉鸡肝脏中AF残留的影响(n=12

Table 2-5 Effects of BMJ ANSB060 on aflatoxin residues in the livers of broilers fed moldy peanut meal naturally contaminated with aflatoxins (n=12)

组别 Group

AFB1* (ng/g)

AFB2* (ng/g)

AFM1* (ng/g)

C0

ND

ND

ND

C1.0

ND

ND

ND

M0

0.24a

0.03a

0.20a

M0.5

0.14b

0.02b

0.12b

M1.0

0.11c

0.01c

0.12b

M2.0

0.09d

0.01c

0.12b

SEM

0.016

0.005

0.012

P

 

 

 

F-test

< 0.001

< 0.001

< 0.001

线性

< 0.001

< 0.001

< 0.001

二次曲线

< 0.001

0.024

< 0.001

注:*霉变日粮中不添加邦霉解ANSB060与添加邦霉解ANSB060的比较(M0 vs. M0.5+M1.0+M2.0)(AFB1P < 0.001AFB2P < 0.001AFG1P < 0.001)。

由图2-3可知,采食C0C1.0日粮的肉鸡十二指肠食糜中未检出AF。饲喂肉鸡M0日粮,其十二指肠食糜中AFB1含量最高,为7.21 ng/g。添加邦霉解ANSB060后,M0.5M1.0M2.0组食糜中AFB1含量,与M0组相比,分别降低了46.05%3.89 ng/g)、67.13%2.37 ng/g)和76.70%1.68 ng/g)。同样,M0组肉鸡十二指肠食糜中AFB2含量最高,为1.94 ng/g。在霉变花生粕日粮中添加0.51.02.0 kg/t 邦霉解ANSB060,可使食糜中AFB2含量分别降低43.81%1.09 ng/g)、62.37%0.73 ng/g)和79.90%0.39 ng/g)。食糜中未检出AFG1AFG2

 

2-3 邦霉解ANSB060对采食AF污染日粮肉鸡十二指肠食糜中AF残留的影响(n=6

Figure 2-3 Effects of BMJ ANSB060 on AFB1 (A) and AFB2 (B) recovered from duodenal content of broilers fed moldy peanut meal naturally contaminated with aflatoxins (n=6)

4 讨论

AF被消化吸收后,主要在肝脏中代谢和蓄积,因此,肝脏是AF主要的靶器官。AF的代谢实际上是肝脏对其进行解毒过程,然而在该过程中肝脏也受到严重损害。血清中ASTALTALP活性被认为是判断动物肝脏功能正常与否的极其重要的指标,血清TP水平是衡量肝脏蛋白合成系统是否正常的重要指标。在本试验中,肉鸡采食被AF污染的日粮,血清中AST活性升高,这表明肉鸡肝脏有一定程度的损伤,肝脏结构的完整性遭到破坏,而使原本分布在肝细胞质中的AST释放到血液循环系统中。尽管试验结果表明AF使AST活性升高,但并未观察到血清TPALTALP含量的变化,Yang等也发现饲喂肉鸡含45.682.4 μg/kg AFB1的日粮,21天后,肉鸡血清中AST活性升高,TPALTALP含量未见变化。肉鸡连续42天采食含50100 μg/kg AFB1的日粮,其血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著升高。但也有一些研究表明,更高剂量的AFB1200300 μg/kg)可显著降低肉公鸡血清中TP含量,升高ASTALTALP活性。含量为2 500 μg/kgAFB1也可导致相似结果。以上结果的不一致可能是由于日粮中AF含量不同、毒素添加方式不同、所选取鸡品种不同、饲喂条件不同等而造成的差异。

大量文献报道显示,AF可导致动物肝脏损伤,甚至导致肝癌的发生。本试验中,尽管未发现血清中TPALTALP含量的变化,但采食被AF污染日粮的肉鸡肝脏略微肿大且颜色苍白,并可见组织病理变化,如胆管增生、肝细胞空泡变性、肝细胞和汇管区淋巴细胞浸润。同样,El-Nekkety等也报道饲喂大鼠被AF污染的日粮,可导致其肝脏汇管区增厚、纤维化以及肝细胞空泡变性、核仁变形。左瑞雨发现AF可导致肉鸡的肝脏细胞肿胀后透明变性,水泡变性,胞浆疏松化,胞浆内出现空泡。本研究结果也从另一方面揭示了血清AST活性变化的原因。

AF在代谢过程中会产生活性氧类ROS),例如超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基等。机体抗氧化防御系统可分为酶类和非酶类两部分,其中SODGSH-Px是清除细胞中ROS的至关重要的抗氧化酶。而当ROS水平超过抗氧化防御系统清除能力的时候,便产生氧化应激,从而导致脂质过氧化终产物MDA的含量上升。本试验发现,饲喂肉鸡被AF污染的日粮,其血清中GSH-Px活性下降,血清和肝脏中MDA含量升高。Li等报道低浓度的AF可导致肉鸡肝脏GSH-Px活性下降,MDA含量升高。Zuo等发现肉鸡连续30天采食含400 μg/kg AFB1的日粮,其血清和肝脏中的SODGSH-Px活性显著下降。以上结果与本试验结果一致。这表明AF霉变日粮可诱发肉鸡肝脏的氧化应激和脂质过氧化,从而导致肝脏组织损伤,进而造成血清生化指标的变化。

AF不仅能引起动物慢性或急性中毒,还可残留在动物产品(如动物组织、牛奶和鸡蛋中)中,通过食物链危害人类健康。AFB1可被代谢转化为AFM1AFP1AFQ1和黄曲霉毒素醇等,或者转化为AFB1-8,9-环氧化物。AFM1毒性低于AFB1,但仍属于剧毒物质,致癌性与AFB1基本相似,为强致癌剂。在本研究中肉鸡采食AF霉变日粮(AFB1=70.7 μg/kg35天,其肝脏可检出AFB1AFB2AFM1,残留量分别为0.240.030.20 μg/kgDenli等报道饲喂肉鸡含有1000 μg/kg AFB1的日粮,肉鸡肝脏中检出0.166 μg/kgAFB1。肉鸡连续42天采食含50100 μg/kg AFB1的日粮,其肝脏中可检测出AFB1(分别为0.050.13 μg/kg)和AFM1(分别为0.100.32 μg/kg)。在以上结果中,AF在肝脏中的转化率不尽相同可能是由于日粮种类、AF含量和作用时间不同所造成。很多国家规定人消费食品中AFB1的含量不能超过2 μg/kg。尽管试验中检出的AFB1残留量都较低,可能对于人们造成的危害较小,但对于动物产品质量控制来说,为了保证公共健康,检测不同组织中AF的残留量仍然是十分必要的。本试验中,肝脏中未检测出AFG1AFG2,同样,Furtado等在采食AF污染日粮的猪的组织中也未检出AFG1AFG2。结果表明AFG1AFG2可能被完全代谢消除,或代谢为无法检测或无法提取的物质。Hussain等发现饲喂28日龄肉鸡AFB1含量为1600 μg/kg的日粮7天,肉鸡肌肉中可检出AFB1,含量为0.41 μg/kg。但本研究在肌肉中未检出AF,可能是由于AF在肌肉中的转化率较低。研究表明肉鸡肌肉中AFB1AFM1的残留量显著低于肝脏中的残留量。

本课题组从鱼肠道分离出一株枯草芽孢杆菌ANSB060,其发酵液在72 h内对AFB1AFG1AFM1的降解率分别达到81.5%80.7%60.0%。研究发现,该菌株的发酵上清液对AF的去毒能力显著高于菌体细胞和胞内提取物,并且上清液经热处理和蛋白酶K处理后,对AF的降解率显著降低,从而可推断ANSB060降解AF的活性物质是一种分泌于发酵上清液中的胞外酶。该菌株可抵抗胃酸、胆盐和高温等不利环境,具有较高的存活率,可抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长,可抵抗动物肠道有害菌的不利影响而发挥正常的生理功能,因此可广泛应用于实际生产中。本课题组前期试验结果表明,AF可导致肉鸡平均日增重和饲料转化效率降低,添加邦霉解ANSB060后可缓解AF造成的不利影响。本试验发现,在正常日粮中添加邦霉解ANSB060,与正对照组相比,各测定指标差异不显著,由此说明,日粮中添加邦霉解ANSB060对肉鸡肝脏功能无不良影响。并且,在霉变日粮中添加邦霉解ANSB060可显著缓解由AF造成的氧化损伤、组织病变和血清生化指标改变,并且缓解程度与添加剂量呈线性相关,当添加剂量为2.0 kg/t时作用效果最明显。在蛋鸡饲养试验中,邦霉解ANSB060同样可使蛋鸡肝脏和血液各指标维持在正常值范围内。有文献报道,一些细菌也具有相似的作用,但其作用机理主要是菌细胞的吸附。干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)具有结合AF的能力,从而减轻毒素对大鼠肝脏的损伤。侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus)同样可吸附AF而缓解日本鹌鹑血清生化指标的改变。这些菌虽然可以缓解AF造成的不良影响,但并没有降解和消除黄曲霉毒素,被吸附的毒素又重新回到环境中,对环境造成二次污染。而邦霉解ANSB060可通过微生物作用降解黄曲霉毒素,不会对环境造成污染,因此其在实际生产中具有广阔的发展前景。本研究结果表明,在霉变日粮中添加邦霉解ANSB060可使十二指肠食糜和肝脏中AF残留量线性下降。这说明邦霉解ANSB060可在动物的胃肠道内降解AF,减少AF的吸收量,降低毒素在组织中的残留量,从而抑制AF对动物和环境的不良影响。

5 结论

5.1 肉鸡采食被AF污染的花生粕后,其血清中ASTGSH-Px活性以及血清和肝脏中MDA含量发生变化,并且肝脏组织有一定损伤;添加邦霉解ANSB060后可缓解AF造成的不良影响。

5.2 肉鸡采食被AF污染的花生粕后,肌肉中未检出AF,十二指肠段食糜和肝脏中可检出AF,饲料中添加邦霉解ANSB060可减少AF在肉鸡十二指肠和肝脏中的残留量,降低毒素对机体的毒害作用以及对环境的污染。