邦霉解ANSB714对采食呕吐毒素污染日粮小鼠的作用效果
来源: | 作者:pro0dd51f | 发布时间: 2019-11-09 | 219 次浏览 | 分享到:

前言

呕吐毒素是粮食和饲料中最常见的一单端孢霉烯族毒素,对人类和畜禽产生广泛的毒性效应,可造成食欲降低、体重减轻、代谢紊乱等症状,严重威胁着畜禽的健康(霍星华等,2008。自DON被发现以来,科学工作者便不断地研究该毒素的去除方法。常用的物理和化学方法虽然能部分去除DON,但存在不可避免的缺点:高温热处理对粮食或饲料营养价值造成破坏,且热分解DON产物毒性未知。用化学试剂处理霉菌毒素,化学试剂的残留问题无法得到有效解决并且多数方法可行性不高存在潜在危险;使用吸附剂吸附作用不专一,在吸附DON的同时还可吸附饲料中的大量营养物质吸附剂很容易吸附一些具有极性基团并且其极性基团处于适当位置的毒素(如黄曲霉毒素不能完全吸附很多毒素如单端孢霉烯毒素DONT-2 毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素等(王金全,2011;吸附剂吸附的毒素没有真正被分解,随机体排出体外后会造成环境二次污染因此生物降解由于其有效性、专一性和环境友好性,将是未来呕吐毒素脱毒的发展趋势。

目前,已报道的能够降解DON的微生物很少有关于动物应用效果研究。本课题组从自然界中分离得到一株能够高效降解DON的菌株,命名邦霉解ANSB714。同时已经对该菌株进行毒理学试验和安全性评价试验,证明该菌对动物安全、低毒因此,本试验进一步通过小鼠呕吐毒素中毒试验,研究其对小鼠DON中毒症的缓解效果,根据动物生产性能、免疫指标、机体抗氧化能力的变化和毒素残留的影响,评价霉菌毒素降解菌对动物健康和畜产品安全的改善效果。为进一步研发和推广可降解呕吐毒素的微生态制剂奠定基础

2 材料与方法

2.1 试验材料

降解DON邦霉解ANSB714,本实验室发酵制成,活菌数4.5×109CFU/mL

2.2 DON污染的饲料原料

从某科研所购买粗提呕吐毒素液体标准品,其中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素均未检出。

2.3 试验动物与管理

雄性3周龄BALB/c小鼠80只,购自北京维通利华试验动物技术有限公司,平均初始体重为11±1g左右,按照随机区组设计分为4个处理,每个处理组5个重复,每四只小鼠一笼为一个重复。各处理间初始体重差异不显著(P>0.05)。雄性小鼠每笼4只饲养于普通笼中,笼底垫上碎木屑并每三天更换,笼具规格:370mm*260mm*170mm。将室内环境控制在23±2、湿度为50±10%、氨浓度≤14mg/m3、噪音≤55dB、光暗周期为12h/12h等。日常用水采用纯净水,经紫外线灭菌,供小鼠自由饮用。用标准化小鼠生长维持期颗粒饲料预饲5天,以适应饲养条件并除去行动异常的不健康动物。所有试验操作按照中国农业大学动物福利的相关程序和要求执行。

2.4 试验设计与试验日粮

基础日粮为标准小鼠生长维持期颗粒饲料,购于北京科澳协力饲料有限公司,呕吐毒素日粮组饲料是将呕吐毒素液体标准品加入到小鼠生长维持期饲料中制成颗粒饲料。处理组分别为:T1组饲喂正常日粮,T2组饲喂正常日粮+邦霉解ANSB714T3组饲喂呕吐毒素日粮(DON含量实测值4.68 mg/kg)和T4组饲喂呕吐毒素日粮+邦霉解ANSB714DON含量实测值4.73 mg/kg)。T2T4组,饮水饲喂ANSB714发酵液(发酵液:水=1:3。试验期28天。试验日粮参照鼠粮推荐标准一次性配制,在试验前取样,分析日粮中的营养成分含量和毒素水平。

试验鼠粮原料组成:玉米、豆粕、鱼粉、面粉、麸皮、食盐、磷酸氢钙、石粉、植物油、多种维生素、多种微量元素和氨基酸等。

                                                     表1-1试验设计

                                                                                          Table 1-1 Experimental design

处理组

日粮及DON含量

T1

正常日粮DON未检出)

T2

正常日粮+邦霉解ANSB714组(DON未检出)

T3

呕吐毒素日粮组(DON含量实测值4.68 mg/kg

T4

呕吐毒素日粮(DON含量实测值4.73 mg/kg+邦霉解ANSB714

注:黄曲霉毒素和赭曲霉毒素均未检出。T1T2组玉米赤霉烯酮未检出。T3T4组玉米赤霉烯酮分别为含量为18.5725.32μg/kg

2.4.1 生产性能测定

试验开始后每天清晨800测定添加的食量和水量, 第二天清晨800对剩余的食物和水称重计算出当天每只小鼠的饮水量和摄食量。每日饲喂前结算饲料消耗,并分别在试验开始7d14d21d28d清晨小鼠空腹重,计算其平均日增重ADG、日采食量ADFI和饲料转化率(F/G)(%平均日增重/日采食量×100)。每天观察小鼠的健康状况并记录。

2.4.2 屠宰试验及样品采集

28日饲喂后禁食,12h后将小鼠用离心管从眼眶腹腔静脉采血约0.6ml。血液在室温静置2h后,于43000r/min 离心10min,收集血清,分装于离心管中,-80保存。检测总蛋白(TP),白蛋白(ALB尿素氮(BUN肌酐(CRE碱性磷酸酶(ALP转氨酶(ALT谷草转氨酶(AST),丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。免疫球蛋白AIgA),免疫球蛋白GIgG)和免疫球蛋白MIgM,白细胞介素-1βIL-1β白细胞介素-2IL-2白细胞介素-6IL-6肿瘤坏死因子(TNF-α)。

小鼠放血死亡后,颈椎脱臼处死后将尸体称重,打开腹腔分离出心脏、肝脏、肾脏以及脾脏等主要器官,仔细按各器官形状剪除剥离其表面黏附的脂肪,用4生理盐水清洗血污,滤纸吸干表面水分和残留血液然后用电子分析天平称量鲜重计算器官指数,研究邦霉解ANSB714对饲喂DON小鼠器官发育的影响。

器官指数=器官重量(g/活体重量(g×100

取小鼠肝脏相同部位组织块、肾脏组织(用手术刀片切开),样品迅速浸入用4%多聚甲醛固定, 待做组织切片。

小肠组织形态观察沿腹部剖开,取出小肠。取十二指肠、空肠和回肠段约1cm长样本,用4%多聚甲醛固定,待做组织切片。

2.4.3 血清生化指标测定

血清生化指标:总蛋白(TP白蛋白(ALB转氨酶(ALT谷草转氨酶(AST碱性磷酸酶(ALP肌酐(CRE尿素氮(BUN采用比色法,用日立7160全自动生化仪进行测定。

2.4.4 免疫指标测定

    免疫球蛋白AIgA),免疫球蛋白GIgG)和免疫球蛋白MIgM,采用比色法,日本日立7160全自动生化仪进行测定白细胞介素-1βIL-1β白细胞介素-2IL-2白细胞介素-6IL-6和肿瘤坏死因子(TNF-α),采用放免法,用放免仪器r-911全自动放免计数仪进行测定。

2.4.5 血清抗氧化指标测定

    血清超氧化物歧化酶(SOD谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px丙二醛(MDA采用比色法,用日本日立7160全自动生化仪进行测定。

2.4.6肝脏抗氧化指标测定

    将小鼠肝组织用组织匀浆机10000r/min(匀浆时间10/次,间隔30秒,连续3次,在冰上进行)制成10%的匀浆液,将制备好的匀浆用冷冻离心机离心10min2000r/min),取上清液待用。组织蛋白质含量采用考马斯亮兰法测定Bradford1976。超氧化物歧化酶SOD)活性、还原性谷胱甘肽GSH活性丙二醛MDA)含量测定采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒所有操作按相应指标的检测说明书进行。

2.4.7组织器官形态学观察

4%多聚甲醛固定液固定的各组织标本,经乙醇逐级脱水,二甲苯透明,再经过包埋机浸蜡、包埋等处理后,使用切片机(德国莱卡RM2015)进行切片(5 μm),经H& E染色,然后使用光学显微镜(Carl ZeissGermany)观察病变特征。

2.4.8肾脏中DON残留量检测

肾脏中的DON的检测参考Goyarts等(2007)的检测方法,并进行部分修改。

试验步骤如下:

1)称取冻干后0.6g 0.4g肾脏样品,加入3mL乙酸钠缓冲液和60μL40μLβ-葡萄糖甘酸/硫酸酯复合酶85000U/ mL 混匀,于37度水浴中12h

2)酶解后加入3mL乙腈,混匀。5000rpm 4离心30min,量取上清液2ml,用8mL pH7.00.1%吐温20 PBS溶液稀释,混匀,5000rpm 4离心10min取上清

3)取8mL上清,以1/秒的流速全部通过DON的免疫亲和柱,直至空气流经亲合柱,然后分别用10mLPBS和双蒸水以12/秒的流速淋洗亲和柱,直至空气流经亲合柱;

4)将试管置于亲和柱下,最后分两次各加入0.5mL甲醇,分别孵育2min,流速为1mL/min左右,收集洗脱液。40氮气吹干,100μL.流动相(乙腈水=10:90)重溶,用于HPLC分析。

2.5 数据统计及分析

SAS 9.0软件的GLM程序对试验数据进行统计分析,以P<0.05为显著水平,方差分析结果显著时进行多重比较,结果用平均值±标准误表示。

3 结果

3.1 邦霉解ANSB714对饲喂DON污染日粮小鼠生产性能的影响

1-2结果显示,28d的试验结束后,与正常日粮组相比,小鼠采食呕吐毒素日粮显著降低了平均日增重和日采食量(P<0.05),其他三组之间平均日增重和日采食量差异不显著(P>0.05)。四组之间饲料转化率差异不显著(P>0.05)。而本试验在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714显著缓解了由呕吐毒素引起的小鼠平均日增重和日采食量的降低。

                      表1-2 邦霉解ANSB714对饲喂DON污染日粮小鼠生产性能的影响n=5

                               Table 1-2 Effects of BMJ. ANSB714 on growth performance of mice exposed to DON (n=5)

处理组

平均日增重(g

平均日采食(g

饲料转化率

T1

0.224±0.004a

3.50±0.03a

15.68±0.25

T2

0.220±0.006a

3.51±0.05a

16.04±0.27

T3

0.204±0.002b

3.30±0.05b

16.28±0.33

T4

0.218±0.004a

3.49±0.03a

16.02±0.60

P

0.037

0.01

0.75

注:同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下表同。

In the same row, values within the same colume with different small letters are significantly differentP<0.05. The same was as below

3.2 邦霉解ANSB714对饲喂DON污染日粮小鼠器官指数的影响

由表1-3结果可知,正常日粮组相比,小鼠采食呕吐毒素日粮升高小鼠了心脏、肝脏、脾脏和肾脏器官指数,说明各器官有肿大症状。而在呕吐毒素日粮组日粮基础上添加邦霉解ANSB714降低了心脏、肝脏、脾脏和肾脏器官指数,改善了DON引起的器官肿大症状。

                        表1-3 邦霉解ANSB714对饲喂DON污染日粮小鼠器官指数的影响n=5

                           Table 1-3 Effects of BMJ. ANSB714 on relative weights of organs of mice when exposed to DON (n=5)

处理组

器官指数 (×10-2

心脏

肝脏

脾脏

肾脏

T1

0.50±0.04

4.27±0.06

0.32±0.01

1.56±0.02

T2

0.51±0.04

4.27±0.07

0.33±0.01

1.58±0.01

T3

0.59±0.01

4.68±0.04

0.35±0.02

1.62±0.02

T4

0.52±0.03

4.46±0.08

0.34±0.01

1.60±0.01

p

0.08

0.18

0.06

0.07

3.3 邦霉解ANSB714对饲喂DON污染日粮小鼠血清生化指标的影响

1-4结果显示,28d的试验结束后,与正常日粮组相比,小鼠采食呕吐毒素日粮降低了TPALB含量,饲喂邦霉解ANSB714缓解了这一影响小鼠采食呕吐毒素组日粮显著升高了BUNCRE含量(P<0.05),而本试验在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714显著缓解了这一影响,并与对照组差异不显著。

                     表1-4 邦霉解ANSB714对饲喂DON污染日粮小鼠血清生化指标的影响n=5

        Table 1-4 Effect of BMJ. ANSB714 on haematological assays and serum chemistry parameters of mice exposed to DON (n=5)

处理组

TP g/L

ALB g/L

ALT U/L

AST U/L

ALP U/L

CRE umol/L

BUN mmol/L

T1

54.91±1.73

22.83±0.71

26.53±7.54

45.52±4.99

161.83±8.54

52.11±2.11b

5.48±0.25b

T2

54.71±1.40

22.55±1.06

27.50±6.39

54.00±12.04

166.33±5.73

55.13±2.31b

5.89±0.35b

T3

47.14±1.23

19.74±0.0.46

36.28±3.38

64.00±3.97

170.65±7.51

62.65±1.48a

7.64±0.64a

T4

52.68±1.23

21.65±0.91

27.59±5.49

64.33±8.53

170.23±9.58

56.54±1.52ab

5.74±0.48b

P

0.06

0.08

0.10

0.33

0.10

0.04

0.02

3.4 邦霉解ANSB714对饲喂DON污染日粮小鼠免疫指标的影响

由表1-5可知,正常日粮组相比,小鼠采食呕吐毒素日粮显著升高了IgAIL-2 IL-6TNF-α含量P<0.05,而本试验在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714缓解了呕吐毒素引起的对免疫性能的负面影响且与对照组差异不显著。

               表1-5 邦霉解ANSB714对饲喂DON污染日粮小鼠免疫指标的影响n=5

       Table 1-5 Effects of BMJ. ANSB714 on immunoglobulin and serum cytokines in mice exposed to DON (n=5)

处理组

IgAg/L

IgGg/L

IgMg/L

IL-1βpg/ml

IL-2pg/ml

IL-6pg/ml

TNF-αpg/ml

T1

1.20±0.13b

2.45±0.18

0.33±0.00

1.30±0.18

26.91±0.95b

130.69±13.02b

56.94±2.92b

T2

1.21±0.19b

2.41±0.35

0.33±0.00

1.44±0.17

26.92±0.45b

137.81±7.91b

57.73±2.11b

T3

2.00±0.13a

3.24±0.13

0.35±0.00

1.81±0.07

29.72±0.67a

180.34±18.40a

65.56±0.49a

T4

1.47±0.29ab

2.55±0.15

0.34±0.00

1.77±0.06

28.08±0.56ab

159.47±11.45b

58.77±1.22b

P

0.03

0.07

0.05

0.05

0.03

0.04

0.03

3.5 邦霉解ANSB714对饲喂DON污染日粮小鼠血清和肝脏抗氧化指标的影响

由表1-6和表1-7可知,正常日粮组相比,饲喂此浓度的呕吐毒素日粮对小鼠血清和肝脏SODGSH-PX活性有一定降低趋势,但未达到显著水平。饲喂此浓度的呕吐毒素日粮对小鼠肝脏中MDA含量有一定升高趋势,但未达到显著水平。而本试验在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714缓解了呕吐毒素对小鼠血清和肝脏抗氧化性能的影响。

                    表1-6 邦霉解ANSB714对饲喂DON污染日粮小鼠血清抗氧化能力的影响n=5

                            Table 1-6 Effects of BMJ. ANSB714 on oxidative status of serum in mice exposed to DON (n=5)

处理组

SODU/ml

GSH-PXU/ml

MDAnmol/ml

T1

100.87±3.00

1159.48±33.32

5.02±0.07

T2

100.96±2.24

1141.81±32.76

5.02±0.11

T3

93.41±1.65

1039.11±27.96

5.31±0.08

T4

97.90±1.31

1044.11±20.96

5.16±0.11

P

0.09

0.07

0.12

                    表1-7 邦霉解ANSB714对饲喂DON污染日粮小鼠肝脏抗氧化能力的影响n=5

                              Table 1-7 Effects of BMJ. ANSB714 on oxidative status of liver in mice exposed to DON (n=5)

处理组

SODU/mgprot

GSH-PXU/mgprot

 MDAnmol/mgprot

T1

37.56±1.36

305.45±16.13

0.38±0.01

T2

36.64±1.04

264.80±12.23

0.42±0.04

T3

31.12±0.92

246.65±14.69

0.44±0.02

T4

36.04±2.56

255.22±18.71

0.39±0.04

P

0.06

0.09

0.07

3.5 邦霉解ANSB714对饲喂DON污染日粮小鼠肾脏DON残留的影响

由表1-8可知,与正常日粮组相比,小鼠采食此浓度的呕吐毒素日粮在肾脏中的呕吐毒素残留为20.2ng/g, 而本试验在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714明显减少了呕吐毒素在肾脏中的残留。

1-8 邦霉解ANSB714对饲喂DON污染日粮小鼠肾脏DON残留的影响n=5

Table 1-8 Effects of BMJ. ANSB714 on DON residues (ng/g) in the kidneys of mice when exposed to DON (n=5)

      处理组

DON在肾脏中的残留(ng/g

T1

ND

T2

ND

T3

20.2±5.8

T4

ND

                *ND =未检测到

3.6 邦霉解ANSB714对饲喂DON污染日粮小鼠组织形态学的影响

在进行屠宰试验时,对肝脏、肾脏和小肠进行的临床观察,没有发现明显的病变。通过对各组织进行病理学组织切片分析(图1-1)发现,与正常日粮组相比,呕吐毒素日粮组中肝脏出现肝窦、中央静脉淤血,肝小叶偶见淋巴细胞浸润;肾脏中肾小管间质轻微淤血,肾小球毛细血管充血;肠粘膜轻微损伤。然而,在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714,肝脏、肾脏和小肠中出现的病变明显减少。


               

    1-1 不同处理组中肝脏、肾脏和小肠组织病理学切片(HE染色40×

Figure 1-1 Photomicrographs optical microscopyof H&E stained liver, kidney, and small intestine from different treatments

讨论

脱氧雪腐镰孢菌烯醇DON又名呕吐毒素,或脱氧瓜萎镰刀菌烯醇,呕吐毒素(DON)对谷物污染率和污染水平居镰刀菌毒素之首,给人和家畜的健康造成巨大威胁Pieters2002 Jelinek1989)采食DON污染的饲粮往往引起拒食和体重的减轻,降低营养物质的利用率,引起消化道损伤,呕吐反应,伴随着出血和免疫失调引起腹泻和严重的皮炎Li2014。采食DON后最初的负效应是采食量的降低。Iverson1995进行了长达2年的DON饲喂试验,雄性和雌性两种性别的B6C3F1小鼠,饲喂0, 1, 5 10 mg/kg四个剂量的DON。结果发现DON会引起肝脏的癌变和由于热量摄入量减少引发肿瘤性病变,且病变程度随DON剂量的增加而增强。本研究结果表明,与正常日粮组相比,小鼠采食呕吐毒素日粮显著降低了平均日增重和日采食量(P<0.05),其他三组之间平均日增重和日采食量差异不显著(P>0.05)。四组之间饲料转化率差异不显著(P>0.0),但采食呕吐毒素日粮组的饲料转化率高于其他各组。这表明在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714显著缓解了由呕吐毒素引起的小鼠平均日增重和日采食量的降低。Smith1997Van Heugten1994)也研究表明DON引起动物生产性能方面的负效应

Swamy2003研究发现,采食DON含量高达5.6mg/kg的自然霉变饲粮,仔猪肝脏、脾脏及肾脏指数并未受到显著影响。苏军2008研究发现,随饲粮中霉变玉米替代比例的增加,脾脏相对重呈线性增加,肾脏相对重呈二次曲线下降,而肝脏、胰脏、胸腺的相对重不会受影响。姬长云等(2014)试验研究结果表明,2mg/kgDON污染饲粮可抑制断奶仔猪的生长性能,但对器官指数不会产生影响可能原因是低剂量的DON对断奶仔猪毒性作用较小仔猪在生长后期对DON产生了一定的耐受作用。本试验中,与正常日粮组相比,小鼠采食呕吐毒素日粮升高小鼠了心脏、肝脏、脾脏和肾脏器官指数,但未达到显著水平,说明各器官有肿大症状。这与之前的研究结果相似。而在呕吐毒素日粮基础上添加邦霉解ANSB714降低了心脏、肝脏、脾脏和肾脏器官指数,改善了DON引起的器官肿大症状。

DON对细胞的影响,常表现为DON与核糖体结合抑制蛋白合成Ehrlich Daigle, 1987)。 而当DON含量低于1mg/kg时,对动物采食量和血液生化指标没有影响或影响较小Accensi等,2006。许多研究也表明当饲粮中DON达到一定含量时,血液生化指标以及酶活性都会受到一定影响,从而间接影响到动物采食量和体增重。本研究试验结果表明,与正常日粮组相比,小鼠采食呕吐毒素日粮后TPALB水平低于正常日粮组,正常日粮+邦霉解ANSB714组和呕吐毒素日粮+邦霉解ANSB714组,且这三组之间差异不显著P>0.05。本试验结果中血清转氨酶活性的升高,表明肝脏有一定程度的受损。当肝脏受到损伤或受到障碍时,肝脏制造过量的ALP,经淋巴道和肝窦进入血液,同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍,反流入血而引起血清ALP明显升高。小鼠采食呕吐毒素日粮后血清ALP升高,表明呕吐毒素引起了肝脏代谢的异常。血清ASTALT同样也是反映肝脏受损的敏感指标。ALTAST主要分布在肝脏的肝细胞内肝细胞坏死时ALTAST就会升高。其升高的程度与肝细胞受损的程度相一致,因此是目前最常用的肝功能指标。这两种酶在肝细胞内的分布是不同的。ALT主要分布在肝细胞浆AST主要分布在肝细胞浆和肝细胞的线粒体中。当肝脏发生严重坏死或破坏时,才能引起AST在血清中浓度升高Huff 等,1986Kubena等,1988, 1989; Harvey等,1991。本试验中,小鼠采食呕吐毒素日粮后血清ALP ALT活性与其他三组相比相对较高,但并达到显著水平P>0.05。这表明4.68mg/kg这一剂量水平DON对肝脏损伤程度不严重。Tiemann等(2006)研究发现,高浓度的呕吐毒素(9.57mg/kg)可以引起肝脏内质网核糖体代谢紊乱。Danicke2006研究表明这一现象可能是蛋白质合成能力的降低引的。血清CREBUN是常用的肾功能检测指标。血清CRE的浓度变化主要由肾小球的滤过能力肾小球滤过率来决定。滤过能力下降,则肌酐浓度升高。血肌酐值高出正常值意味肾脏受损血肌酐能较准确的反应肾实质受损的情况(Inker等,2012Rule, 2013) 。本试验中小鼠采食呕吐毒素日粮后血清CREBUN显著高于正常日粮组,正常日粮+邦霉解ANSB714组和呕吐毒素日粮+邦霉解ANSB714P<0.05,且这三组之间差异不显著P>0.05。以上结果表明在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714显著缓解了呕吐毒素引起的小鼠血清生化的负效应,并使之接近正常对照组的状态。

免疫系统对DON非常敏感Pestka 2004 DON对免疫系统的最主要的影响是血清IgA 的升高。另外,IgA 升高还会诱发小鼠和人类的IgA 肾病Pestka2003JiaPestka2005DON 能刺激IgA 分泌细胞的增殖和活性,促进巨噬细胞和T细胞产生细胞因子, 从而引起血清IgMIgG的增加。Greene等进行了为期12周的DON诱发B6C3F1大鼠肾病的研究,DON的浓度为021025mg/kg,动物分为雌、雄两组,试验组动物血浆中IgA 含量明显升高,雄性与雌性试验组间存在着显著性差异,雄性IgA 含量较雌性高,说明雄性动物较雌性动物敏感。Thuvander1999报道,呕吐毒素在高浓度剂量抑制体外培养的人外周淋巴细胞增殖及免疫球蛋白的产生,而低浓度则使免疫球蛋白升高。Iverson1996用大鼠进行了为期2年的攻毒试验,呕吐毒素的浓度为01510mg/kg,雄性、雌性大鼠各分为4组,试验结果发现,各组动物均未见死亡,动物体重增加与攻毒剂量呈负相关。雌性大鼠的血浆中IgAIgG浓度较对照组增高,生化指标、血液学指标也可见明显异常。本试验结果表明,与其他三组相比,小鼠采食呕吐毒素日粮显著升高了血清IgA含量(P<0.05),同时升高了血清IgMIgG的含量,但未达到显著水平。正常日粮组,正常日粮+邦霉解ANSB714组和呕吐毒素日粮+邦霉解ANSB714组之间血清IgAIgMIgG的含量差异不显著。细胞因子在免疫应答中有着非常重要的作用Pestka2004DON既是一种免疫促进剂,又是一种免疫抑制剂,这主要取决于毒素的剂量、暴露频率和检测免疫功能的时间等。低剂量的单端孢霉烯族毒素会促进细胞因子的增殖引起免疫刺激,高剂量则会诱发细胞凋亡。本试验结果表明,小鼠采食呕吐毒素日粮显著升高了血清IL-2, IL-6TNF-α含量(P<0.05),正常日粮组,正常日粮+邦霉解ANSB714组和呕吐毒素日粮+邦霉解ANSB714组之间血清IL-2, IL-6TNF-α含量差异不显著。与其他三组相比,小鼠采食呕吐毒素日粮升高了血清IL-1β的水平,但未达到显著程度。本试验结果表明DON升高了血清IL-1βIL-6TNF-α的水平,这与之前报道的试验结果相似。Zhou1998研究发现DON可以促进IL-2TNF-α mRNA的表达。有研究表明,DON的毒理作用,可能是DON与真核细胞核糖体60s亚基上的酞酰基转移酶结合,同时引起MAPK磷酸化,发生炎症反应,从而对机体产生毒害作用Pestka2003。综上所述,而本试验在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714缓解了呕吐毒素引起的对免疫性能的负面影响。

超氧化物歧化酶(SOD)在维持体内超氧阴离子产生与消除的动态平衡起重要作用,它催化超氧阴离子自由基发生歧化反应,从而清除氧自由基。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是广泛存在于机体内的一种重要的过氧化氢分解酶,该酶特异性催化还原型谷胱甘肽过氧化氢的还原反应,从而保护细胞膜结构和功能的完整性。这个系统的酶类可因体内自由基化合物数量的增加而被诱导合成,它们的含量和活性影响机体内活性氧自由基的水平以及脂质过氧化终末代谢产物丙二醛(MDA)的含量Wills1966。这一系列酶活性的变化反映肝脏清除自由基能力的强弱。DON被报道会引起肝脏损伤,同时降低其清除氧自由基的能力(Zhang等,2010Srilatha2010。在试验中,与正常日粮组,正常日粮+邦霉解ANSB714组和呕吐毒素日粮+邦霉解ANSB714组相比,小鼠采食呕吐毒素日粮降低了血清和肝脏中SODGSH-Px酶活性,增加了MDA含量。而本试验在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714可以缓解由呕吐毒素引起的血清和肝脏中SODGSH-Px酶活性的降低,降低MDA含量。

DON在体内吸收迅速,并分布于全身各组织当中。DON可在口服15min内诱导肝脏第一和第二阶段生物转化酶的产生Bensassi等,2005,但并不通过细胞色素P450途径代谢Lewis等,1999DON的代谢去路可分为两部分,一部分DON在肝脏与葡萄糖醛酸发生共轭,以原型或共轭化合物形式从尿中排泄另一部分DON主要由肠道微生物通过去环氧化反应产生去环氧化合物DOM-l由粪中排出,此过程不经过肝脏和其他组织的转化He等,1992Yordanova2003DON酶联免疫吸附测定的方法研究发现,小鼠口服25mg/kg体重DON30min时检测到体内各处DON毒性大小顺序为肾脏>心脏>血浆>肝脏>胸腺>脾脏>脑,并且24hDON被迅速清除。DON的浓度从30min-8h在所有被检器官有很大程度的增加,但在24h时只在肾脏中被检出DON。万丹等2012研究发现DON在动物体内吸收好、排泄迅速。低剂量DON经尿液排泄的比例较高剂量高雄性动物经尿液排泄的比例比雌性动物低。该化合物可穿透血脑屏障和血辜屏障, 广泛分布全身各组织。其中DON肾脏消除最慢, 故肾脏是DON残留靶组织。本试验结果表明,小鼠采食此浓度的呕吐毒素日粮在肾脏中的呕吐毒素残留为20.2ng/g, 而本试验在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714明显减少了DON在肾脏中的残留。

李群伟等2007观察了DON对家兔多脏器损伤的病理切片结果发现家兔、肝、脾脏和均有炎症和细胞坏死现象。Iverson1996用大鼠进行呕吐毒素浓度为01510mg/kg攻毒试验,该试验进行了2年。试验雄性、雌性大鼠各分为4 组,试验结果发现,各组动物均未见死亡,动物体重增加程度DON攻毒剂量呈负相关。其中病理学检查还发现有肝脏肿瘤、肝脏坏死现象。朱于斌(2012)试验选用健康成年雌性小鼠体重为20±lg270,采用二因素三水平设计, DON浓度水平分别为01.52.5mg/kgBW, ZEA浓度水平为02030 mg/kgBW,每隔24h腹腔注射染毒连续注射4d。在首次染毒后第35812d采样观察肝肾病理学变化。DONZEA单一毒素染毒组小鼠肝脏和肾脏并没有发现明显的病理损伤但联合染毒组肝脏发生空泡变性肝细胞肿大肾脏肾小球有出血点肾小管上皮细胞发生空泡变性肾小管结构消失。相比小鼠呕吐毒素染毒试验,陈明洪(2013)饲喂育肥猪DON含量为3.407mg/kg 的日粮60d其中对照组肝小叶、门管区正常肝细胞轮廓清晰胞质均匀,DON组可见明显的淋巴细胞坏死肝细胞排列混乱血窦受挤压变形等现象。对照组肠道绒毛和隐窝结构完整无绒毛脱落等现象,DON组可看到绒毛顶端上皮脱落绒毛结构受损较大缺失或崩解,仅少量绒毛保存完好。可能因为小鼠对于呕吐毒素的耐受性较猪强,因此呕吐毒素对于小鼠内脏器官的损害作用没有猪明显。本试验中,饲喂小鼠4.68mg/kg浓度的呕吐毒素日粮后,对肝脏、肾脏和小肠进行的临床观察,没有发现明显的病变。通过对各组织进行病理学组织切片分析发现,呕吐毒素日粮组中肝脏出现肝窦、中央静脉淤血,肝小叶偶见淋巴细胞浸润;肾脏中肾小管间质轻微淤血,肾小球毛细血管充血;肠粘膜轻微损伤。在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714,肝脏、肾脏和小肠中出现的病变明显减少,缓解了DON对小鼠肝脏、肾脏和小肠的损害。

5 结论

5.1 小鼠采食呕吐毒素日粮显著降低了平均日增重和日采食量。在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714显著缓解了由呕吐毒素引起的小鼠平均日增重和日采食量的降低。

5.2 小鼠采食呕吐毒素日粮升高了小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏器官指数。在呕吐毒素日粮基础上添加邦霉解ANSB714降低了心脏、肝脏、脾脏和肾脏器官指数,改善了DON引起的器官肿大症状。

5.3 小鼠采食呕吐毒素日粮降低了TPALB含量,饲喂邦霉解ANSB714缓解了这一影响。小鼠采食呕吐毒素组日粮显著升高了CREBUN含量,在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714显著缓解了这一影响,并与对照组差异不显著。

5.4 小鼠采食呕吐毒素日粮显著升高了IgAIL-2 IL-6TNF-α含量,在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714缓解了呕吐毒素引起的对免疫性能的负面影响且与对照组差异不显著。

5.5 小鼠采食此浓度的呕吐毒素日粮对血清和肝脏SODGSH-PX活性有一定降低趋势并对肝脏中MDA含量有一定升高趋势。在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714缓解了呕吐毒素对血清和肝脏抗氧化性能的影响。

5.6 在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714明显减少了呕吐毒素在肾脏中的残留。

5.7呕吐毒素日粮组中肝脏出现肝窦、中央静脉淤血,肝小叶偶见淋巴细胞浸润;肾脏中肾小管间质轻微淤血,肾小球毛细血管充血;肠粘膜轻微损伤。然而,在饲喂DON日粮的基础上添加邦霉解ANSB714,肝脏、肾脏和小肠中出现的病变明显减少。