一、方法概述

用乙腈提取饲料或饲料原料（如DDGS）中玉米赤霉烯酮，提取液经过滤、旋干浓缩、甲醇溶解后，加入培养基和邦霉解，暗处37℃培养。反应结束后，用免疫亲和柱-高效液相色谱法测定其中玉米赤霉烯酮的含量，从而确定邦霉解对玉米赤霉烯酮的降解率。

二、仪器和设备

实验室常规仪器、设备及下列各项。

2.1  分析天平                        Sartorius

2.2  320-S型pH计                   METTLER

2.3  YX-280D型高压蒸汽灭菌器       合肥华泰医疗设备有限公司

2.4  生物安全柜（Class 2 Type B2型）  北京东联哈尔仪器制造有限公司

2.5  超净工作台                      哈尔滨东联电子设备有限公司

2.6  旋涡混合器                      上海琪特分析仪器有限公司

2.7  恒温振荡器                      太仓市实验仪器制造厂

2.8  旋转蒸干仪                      上海比朗仪器有限公司

2.9  高速离心机                      北京医用离心机厂

2.10  玻璃纤维滤纸                   英国Whatman公司

2.11  玉米赤霉烯酮免疫亲和柱         北京中检维康技术有限公司

2.12  10 mL玻璃注射器

2.13  泵流操作架                     北京中检维康技术有限公司

2.14  高效液相色谱仪LC-10AT         日本岛津公司

2.15  RF-20A荧光检测器              日本岛津公司

2.16  色谱柱：Dikma C₁₈柱（柱长150 mm，内径4.6 mm，填料直径5 μm）

2.17  HPLC ChemStation软件系统       杭州普惠科技有限公司

2.18  100 μL微量注射器

2.19  500 mL三角瓶

2.20  100 mL三角瓶

2.21  50 mL三角瓶

2.22  5 mL棕色小瓶

三、试剂和溶液

除非另有特别说明，仅使用分析纯试剂、去离子水。

3.1  pH7.0 PBS缓冲液：称取8.0 g氯化钠，1.2 g磷酸氢二钠，0.2 g磷酸二氢钾，0.2 g氯化钾，用990 mL纯水溶解，然后用盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000 mL。

3.2  甲醇：色谱纯。

3.3  LB培养基：（每升）为蛋白胨10 g，氯化钠10 g，酵母浸粉5 g，pH值调整到7.2。将50 mL培养基分装至250 ml三角瓶中，使用16层纱布加4层报纸封口。然后在高压灭菌锅中灭菌20 min。

3.4  乙腈-水-甲醇（46:46:8）：取46 mL色谱纯乙腈加46 mL双蒸水加8 mL甲醇。

3.5  玉米赤霉烯酮标准品（Supelco公司）。

四、试样准备

4.1 固体样品

玉米赤霉烯酮生物降解剂（固体邦霉解），按GB/T14699.1的规定进行采样，选取有代表性样品。

含有高浓度玉米赤霉烯酮的饲料或饲料原料，取样方法同上。

4.2 液体样品

玉米赤霉烯酮生物降解剂（液体邦霉解），按GB/T14699.1的规定进行采样，选取有代表性样品。

五、分析步骤

5.1饲料或饲料原料中玉米赤霉烯酮的提取

取1个500 mL三角瓶，称取50 g粉碎好的饲料或饲料原料，加250 mL乙腈，摇床震荡提取2小时以上，定性滤纸过滤，将滤液混合均匀。

5.2饲料或饲料原料提取液中玉米赤霉烯酮检测

①提取液前处理

取5.1步中滤液10 mL（V₁）于100 mL三角瓶中，用40 mL（V₂）PBS缓冲液稀释滤液，使乙腈含量低于20％，混合均匀，玻璃纤维滤纸过滤。

②净化

将免疫亲和柱上方接上10 mL玻璃注射器筒。去掉亲和柱下方堵头，弃去柱中保护液。准确移取上步滤液10 mL（V₃），注入玻璃注射器中。将空气压力泵与注射器相连接，调节压力，使溶液以约1 mL/min左右的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。加入10 mL双蒸水洗涤2次，调节流速为3 mL/min左右，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液。

③洗脱

最后分4次各加入0.5 mL甲醇（总体积为2 mL，V₄），分别孵育2 min，流速为1 mL/min左右，收集洗脱液于5 mL棕色小瓶中，洗脱液用于HPLC分析。

5.3 降解反应

①反应体系

根据提取液中玉米赤霉烯酮含量取第5.1步中滤液于250ml脂肪瓶中，65℃旋干（无法完全旋干，仍有少量液体残留），用甲醇溶解，将玉米赤霉烯酮溶解液与LB培养基以1:9比例混合均匀备用。

注：根据第5.2步中测得到的提取液中玉米赤霉烯酮含量来确定需要旋干的提取液的量。使得旋干后加入甲醇溶解的液体中玉米赤霉烯酮含量约为5 ppm，加入LB培养基后反应体系终浓度约为500 ppb左右。

注：由于甲醇溶解液与LB培养基混合液中杂质（如脂肪、油等）含量较高，影响菌的生长，因此，可适当考虑将混合液过滤，但经过过滤后玉米赤霉烯酮的含量会降低，此步骤还需进一步摸索和改进。

②反应条件

取20mL含玉米赤霉烯酮培养基加0.2mL液体邦霉解或0.2g固体邦霉解，混合均匀后，再使用封瓶膜封口，然后于37℃ 200r/min摇床中反应。

5.4 检测方法

①取样

分别于反应0h和48h时，分别取对照组和处理组混合液各1 mL（V₅）于50 mL三角瓶中。

②样品前处理

于50 mL三角瓶中再加9 mL（V₆）乙腈，然后高速搅拌提取3 min，静置，过滤。用40mL（V₇）PBS缓冲液稀释滤液，使乙腈含量低于20％，然后过滤。

③净化

将免疫亲和柱上方接上10 mL玻璃注射器筒。去掉亲和柱下方堵头，弃去柱中保护液。准确移取上步滤液10 mL（V₈），注入玻璃注射器中。将空气压力泵与注射器相连接，调节压力，使溶液以约1 mL/min左右的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。加入10 mL双蒸水洗涤2次，调节流速为3 mL/min左右，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液。

④洗脱

最后分4次各加入0.5 mL甲醇（总体积为2 mL，V₉），分别孵育2 min，流速为1 mL/min左右，收集洗脱液于5 mL棕色小瓶中，洗脱液用于HPLC分析。

⑤玉米赤霉烯酮标准工作液制备

将玉米赤霉烯酮固体标准品（购自Supelco公司）溶解在甲醇（色谱纯）中，配置成5000 ng/mL（5 ppm）。准确吸取一定量5000 ng/mL的玉米赤霉烯酮标准工作液，使用流动相稀释，分别配制成125 ng /mL、62.5 ng/mL、31.25 ng/mL、15.625 ng/mL、3.125 ng/mL、1.04 ng/mL系列的标准工作液。放入-20℃冰箱中备用。

⑥标准曲线的测定

以玉米赤霉烯酮标准工作液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，使用标准曲线对检测样品中玉米赤霉烯酮浓度进行定量。

5.5 色谱条件

色谱柱：Dikma C18，150 mm×4.6 mm×5μm；

流动相：乙腈：水：甲醇=46：46：8；

流速：1 ml/min；

检测波长：激发波长374 nm，发射波长440 nm；

上样量：20 μL；

玉米赤霉烯酮的出峰时间：11~12 min。

5.6 注意事项

(1)操作步骤中，样品过柱，淋洗，洗脱时，一定要控制好流速，不能太快，否则会使检测结果偏低。

(2)如果将标准品直接过柱验证回收率时，一定要确保标准上柱液中乙腈浓度不要超过20%，否则会影响柱子的吸附能力。

(3)试验中使用的玻璃仪器等，一定要清洗干净，尤其是用次氯酸等处理过的仪器，否则会使检测结果偏低。

5.7 结果计算

①根据绘制的标准工作曲线对检测样品中玉米赤霉烯酮（ZEN）含量计算

标准曲线公式：Y=aX+b

X：检测样品的玉米赤霉烯酮浓度

Y：检测样品峰面积

②饲料或饲料原料提取液中玉米赤霉烯酮的含量C_T

Y_T：上机测定样品的峰面积；

V₄：用色谱纯甲醇洗脱的总体积（mL）；

V₃：过免疫亲和柱的样品的上柱体积（mL）；

V₁：提取液过滤后所取滤液得体积（mL）；

V₂：稀释所用PBS缓冲液的体积（mL）；

③邦霉解对饲料或饲料原料提取液中玉米赤霉烯酮的降解率P

P：邦霉解对饲料或饲料原料提取液中玉米赤霉烯酮的降解率（%）；

C₄₈：48h处理组反应液中ZEN浓度（ng/mL）；

C₀：0h对照组反应液中ZEN浓度（ng/mL）；

X₄₈：48h处理组样品上机测定的ZEN浓度（ng/mL）；

X₀：0h对照组样品上机测定的ZEN浓度（ng/mL）；

T：所取的1mL反应液在处理过程中的稀释倍数；

T：所取的1mL反应液在处理过程中的稀释倍数；

V₉：用色谱纯甲醇洗脱的总体积（mL）；

V₈：过免疫亲和柱的样品的上柱体积（mL）；

V₅：吸取各组反应液的体积（1mL）；

V₆：终止反应所用乙腈的体积（9mL）；

V₇：稀释所用PBS缓冲液的体积（mL）；

④邦霉解对饲料或饲料原料提取液中ZEN的降解量M

M=C₀-C₄₈=(X_0－X₄₈)×T

M：邦霉解对饲料或饲料原料提取液中ZEN的降解量（ng/mL）；

C₀：0h对照组反应液中ZEN浓度（ng/mL）；

C₄₈：48h处理组反应液中ZEN浓度（ng/mL）；

X₀：0h对照组样品上机测定的ZEN浓度（ng/mL）；

X₄₈：48h处理组样品上机测定的ZEN浓度（ng/mL）；

T：取样的1mL反应液在处理过程中的稀释倍数；

⑤结果表示与重复性

两个平行试样的测定结果使用算术平均数表示。同一试样两个平行测定值的相对偏差小于10%。