生物降解霉菌毒素机理研究及降解产物分析
来源: | 作者:中国农业大学 北京世纪鸿邦生物科技有限公司 | 发布时间: 2019-11-09 | 181 次浏览 | 分享到:

一、AFB1降解产物结构分析

1)质谱分析

1-1 显示了黄曲霉毒素B1经活性蛋白处理前后的质谱峰变化。黄曲霉毒素标准品的质谱特征峰是位于分子量313的加氢峰,335的加钠峰和351的加钾峰(图1-1A)。空白缓冲体系溶解后的黄曲霉毒素出现一些背景杂峰,但特征峰未改变(图1-1B),而用粘细菌解毒蛋白处理后的毒素,相应的313特征峰大大降低,而335351特征峰消失(图1-1C),从而确证活性蛋白处理后AFB1的含量大大降低。

2)红外分析

利用傅立叶红外光谱测定比较AFB1标样和经活性蛋白处理72 h后的AFB1观察到吸收峰主要变化发生在1640cm-11728cm-12930cm-1处(图1-2A, 1-2B),三处对应的官能团分别为芳香酮震动收缩,芳香内酯震动收缩和甲基正反对称收缩。结果表明,经活性蛋白处理后,AFB1分子上的芳香内酯键和C-8位上的甲氧基发生改变。芳香内酯键AFB1分子主要的毒性基团,该基团的改变有可能使毒素毒性降低。

  

1-1A  AFB1标准品的质谱图

 

  

1-1B  空白缓冲体系+AFB1标准品,反应80 h后的质谱图

 

  

1-1C  活性蛋白+缓冲体系+AFB1标准品,反应80 h后的质谱图

   

1-2A  黄曲霉毒素B1标样的红外光谱图

 

1-2B  黄曲霉毒素AFB1经粘细菌活性蛋白处理后的红外光谱图

本试验采用红外和质谱分析推测反应产物的分子结构。质谱结果表明,粘细菌解毒蛋白处理后的毒素,相应的313特征峰大大降低,而335351特征峰消失。红外测定结果表明,活性蛋白处理后的毒素,其吸收峰主要变化发生在1409cm-11728cm-1  2930cm-1处,推测是苯环上的芳香内酯和甲氧基发生改变,是不同于前人报道的新的解毒途径。在黄曲霉毒素B1分子中,芳香内酯和双呋喃环被认为是毒性和致癌基团 (Lee et al, 1981)。破坏或改变该基团,将会使毒性大大降低。对降解产物分子结构的完全解析,要依靠核磁共振测定。该测定方法对降解产物的浓度有要求,而且必须将各种产物分离纯化,工作量巨大。考虑到黄曲霉毒素价格昂贵,本试验每个处理的初始毒素浓度只有100 ppb, 很难达到核磁共振对浓度的要求,因此没有采用该方法。另外,活性蛋白对黄曲霉毒素的解毒作用效果和安全性,最终要通过动物饲养试验加以验证。

 

二、ZEA降解产物结构分析

ZEA分子量是318,由于分子中含有两个酚羟基,容易电离形成负离子,因此,质谱检测采取负离子模式,测得质荷比为317。峰面积的大小可以表征溶液中化合物含量的多少。如图2-1所示,空白溶液中,完全不含有317;而在降解试验的不同时间点,317物质含量随时间增加而降低,96小时含量为最低值,表明在反应体系中随时间增加ZEA含量降低。


2-1不同反应时间的ZEA及其代谢产物M1M2谱图

Figure 2-1 The mass spectrogram of ZEA and its degradation products M1 and M2 in different reaction time

2-12-2显示,ZEA317)出峰时间靠前处,出现两个具有相同变化规律的代谢物M1M2,负离子模式下分子离子峰分别为446404,说明M1M2对应化合物分子量为447405M1M2含量初期随时间上升,在2024小时达到峰值,随后含量峰开始回落(图2-2)。并且在ANSB01G空白对照组中没有发现上述两种化合物。因此,推测这两种化合物为ZEA的代谢物。

 


2-2 代谢物M1446)和M2404)变化趋势

Figure 2-2 The mass spectrogram of ZEA degradation products M1 and M2 in different reaction time

 

根据M1M2的分子量447405均为奇数,推测分子中可能含有氮元素。由于M1M2分子量均大于ZEA的分子量318,推测首先ZEA与含氮化合物结合。且生物体内常见含氮化合物为氨基酸,推测代谢物可能是ZEA与氨基酸进行结合的产物。

首先,假设M1ZEA的初级代谢产物,M2为次级代谢产物。M1与氨基酸结合过程需要脱去一分子水,因此,结合的氨基酸分子量应该为447-318+18=147,推测与ZEA结合的氨基酸为谷氨酸。基于分子量为405M2为次级代谢物的假设,而M2通过二级质谱出现了分子离子峰为329的二级质谱碎片(图2-3),显示脱去了一个分子量为75的中性分子,推测为甘氨酸,因此谷氨酸结构中的α-碳上的羧基和氨基应该没有发生变化才有可能脱去一分子的甘氨酸。于是推测与ZEA酚羟基进行酯化的应该是谷氨酸的γ-羧基,结构如图2-4


2-3 M1446)和M2404)的二级质谱图

Figure 2-3 HPLC-MS/MS spectrogram of M1 446and M2 404

2-4 初级代谢物(M1)结构图

Figure 2-4 The chemical structure of primary metaboliteM1

由于氨基酸结构相对稳定,M2分子中α-碳上的羧基和氨基应该没有发生变化。因此,推测与M1相比,分子结构中发生变化的应该是ZEA的碳链环部分。根据UtermarkVekiru等报道,ZEA常见的代谢途径是水解内酯环,然后脱羧,以及羰基的还原。得到的化合物如图2-5所示:

2-5 初级代谢物(M1)内酯环水解后结构图

Figure 2-5 The chemical structure after the lactone ring of primary metabolite (M1) was hydrolyzed

2-5所示化合物分子量与分子量为405M2只差一分子水。从M2的二级质谱图中出现脱去一分子水的387碎片而没有脱去两分子水的368碎片也能够推测,405分子碳链上只含有一个羟基,因为酚羟基难以脱水。因此,推测在423的基础上发生了一个脱水反应,生成了图2-6所示的代谢物。

2-6 次级代谢物(M2)结构图

Figure 2-6 The chemical structure of secondary metabolite (M2)

综上所述,推测菌株ANSB01G降解ZEA的代谢途径如下(图2-7):

2-7 ZEA代谢途径

Figure 2-7 The metabolic pathway of ZEA

三、DON降解产物结构分析

DON分子量是296,容易电离形成负离子331,因此,质谱检测采取负离子模式,测得质荷比为331。峰面积的大小可以表征溶液中化合物含量的多少。如图3-1所示,空白溶液中,完全不含有263;而在降解试验的不同时间点,331物质含量随时间增加而降低,120小时含量为最低值,表明在反应体系中随时间增加DON含量降低。


3-1不同反应时间的DON及其降解产物(箭头指示)谱图

Figure 3-1 The mass spectrogram of DON and its degradation products in different reaction time

3-2 DON降解产物质谱图

Figure 3-2 The mass spectrogram of DON degradation products

3-2所示化合物分子量与分子量为331DON,分子量相差2。推测可能是DONC3-OH基团发生氧化生成了基。综上所述,推测菌株ANSB714降解DON的代谢途径如下(图3-3):


3-3 DON代谢途径

Figure 3-3 The metabolic pathway of DON

国内外有关DON生物降解的研究主要包括酶降解法和微生物降解法两种方式,而微生物降解是目前去除呕吐毒素污染研究的重点。研究表明DON结构中C12 C13位的环氧基团C3-OH基团是DON的主要毒性基团,也是生物降解主要研究位点Pestka2007)。 

本研究通过HPLC-MS/MS法对德沃斯氏菌ANSB714降解DON的作用机制进行研究。初步判断德沃斯氏菌ANSB714DON降解成为3-keto-deoxynivalenol,将C3OH基团氧化为,从而降低DON毒性Sato2011从来自于土壤和小麦叶的微生物中分离出4种革兰氏阴性Devosia sp.属微生物9革兰氏阴性Nocardioides属微生物分析检测13微生物可将DON转化成为3-epi-deoxynivalenolShima1997通过富集培养方法从土壤中筛选得到一株土壤杆菌属的细菌E3-39,该菌30厌氧条件下胞外提取液将培养基中200μg/mLDON代谢掉,代谢产物中70%3-酮基-DONVölkl 2004)从自然界样品中分离一株具有将DON降解3-酮基-DON的细菌D107,该菌在20条件下保存6个月仍能保持DON的降解能力徐剑宏等(2010)筛选出一株德沃斯氏菌,并命名为DDS-1,该菌不但可以降解DON标准品,还可以降解饲料中的DON,并发现该菌首先把DON氧化成3-AC-DON,然后进行下一步反应。随后,徐剑宏等(2013)发现该德沃斯氏菌DDS-1在适宜的温度和稳定的pH以及金属离子作为辅因子条件下,产3-AC-DON氧化酶,首先把DON氧化成3-AC-DON,再往下氧化为3-酮基-DON,这一反应可使DON的毒性大大降低。