一、AFB₁降解产物结构分析

（1）质谱分析

图1-1 显示了黄曲霉毒素B₁经活性蛋白处理前后的质谱峰变化。黄曲霉毒素标准品的质谱特征峰是位于分子量313的加氢峰，335的加钠峰和351的加钾峰（图1-1A）。空白缓冲体系溶解后的黄曲霉毒素出现一些背景杂峰，但特征峰未改变（图1-1B），而用粘细菌解毒蛋白处理后的毒素，相应的313特征峰大大降低，而335和351特征峰消失（图1-1C），从而确证活性蛋白处理后AFB₁的含量大大降低。

（2）红外分析

利用傅立叶红外光谱测定比较AFB₁标样和经活性蛋白处理72 h后的AFB₁，观察到吸收峰主要变化发生在1640cm^-1，1728cm^-1和2930cm^-1处（图1-2A, 1-2B），三处对应的官能团分别为芳香酮震动收缩，芳香内酯震动收缩和甲基正反对称收缩。结果表明，经活性蛋白处理后，AFB₁分子上的芳香内酯键和C-8位上的甲氧基发生改变。芳香内酯键是AFB₁分子主要的毒性基团，该基团的改变有可能使毒素毒性降低。

  

图1-1A  AFB₁标准品的质谱图

 

  

图1-1B  空白缓冲体系+AFB₁标准品，反应80 h后的质谱图

 

  

图1-1C  活性蛋白+缓冲体系+AFB₁标准品，反应80 h后的质谱图

   

图1-2A  黄曲霉毒素B₁标样的红外光谱图

 

图1-2B  黄曲霉毒素AFB₁经粘细菌活性蛋白处理后的红外光谱图

本试验采用红外和质谱分析推测反应产物的分子结构。质谱结果表明，粘细菌解毒蛋白处理后的毒素，相应的313特征峰大大降低，而335和351特征峰消失。红外测定结果表明，活性蛋白处理后的毒素，其吸收峰主要变化发生在1409cm^-1，1728cm^-1 和 2930cm^-1处，推测是苯环上的芳香内酯和甲氧基发生改变，是不同于前人报道的新的解毒途径。在黄曲霉毒素B₁分子中，芳香内酯和双呋喃环被认为是毒性和致癌基团 (Lee et al, 1981)。破坏或改变该基团，将会使毒性大大降低。对降解产物分子结构的完全解析，要依靠核磁共振测定。该测定方法对降解产物的浓度有要求，而且必须将各种产物分离纯化，工作量巨大。考虑到黄曲霉毒素价格昂贵，本试验每个处理的初始毒素浓度只有100 ppb, 很难达到核磁共振对浓度的要求，因此没有采用该方法。另外，活性蛋白对黄曲霉毒素的解毒作用效果和安全性，最终要通过动物饲养试验加以验证。

 

二、ZEA降解产物结构分析

ZEA分子量是318，由于分子中含有两个酚羟基，容易电离形成负离子，因此，质谱检测采取负离子模式，测得质荷比为317。峰面积的大小可以表征溶液中化合物含量的多少。如图2-1所示，空白溶液中，完全不含有317；而在降解试验的不同时间点，317物质含量随时间增加而降低，96小时含量为最低值，表明在反应体系中随时间增加ZEA含量降低。

图2-1不同反应时间的ZEA及其代谢产物M1和M2谱图

Figure 2-1 The mass spectrogram of ZEA and its degradation products M1 and M2 in different reaction time

图2-1与2-2显示，ZEA（317）出峰时间靠前处，出现两个具有相同变化规律的代谢物M1和M2，负离子模式下分子离子峰分别为446和404，说明M1和M2对应化合物分子量为447和405。M1和M2含量初期随时间上升，在20和24小时达到峰值，随后含量峰开始回落（图2-2）。并且在ANSB01G空白对照组中没有发现上述两种化合物。因此，推测这两种化合物为ZEA的代谢物。

图2-2 代谢物M1（446）和M2（404）变化趋势图

Figure 2-2 The mass spectrogram of ZEA degradation products M1 and M2 in different reaction time

 

根据M1和M2的分子量447和405均为奇数，推测分子中可能含有氮元素。由于M1和M2分子量均大于ZEA的分子量318，推测首先ZEA与含氮化合物结合。且生物体内常见含氮化合物为氨基酸，推测代谢物可能是ZEA与氨基酸进行结合的产物。

首先，假设M1为ZEA的初级代谢产物，M2为次级代谢产物。M1与氨基酸结合过程需要脱去一分子水，因此，结合的氨基酸分子量应该为447-318+18=147，推测与ZEA结合的氨基酸为谷氨酸。基于分子量为405的M2为次级代谢物的假设，而M2通过二级质谱出现了分子离子峰为329的二级质谱碎片（图2-3），显示脱去了一个分子量为75的中性分子，推测为甘氨酸，因此谷氨酸结构中的α-碳上的羧基和氨基应该没有发生变化才有可能脱去一分子的甘氨酸。于是推测与ZEA酚羟基进行酯化的应该是谷氨酸的γ-羧基，结构如图2-4。

图2-3 M1（446）和M2（404）的二级质谱图

Figure 2-3 HPLC-MS/MS spectrogram of M1 （446） and M2 （404）

图2-4 初级代谢物（M1）结构图

Figure 2-4 The chemical structure of primary metabolite（M1）

由于氨基酸结构相对稳定，M2分子中α-碳上的羧基和氨基应该没有发生变化。因此，推测与M1相比，分子结构中发生变化的应该是ZEA的碳链环部分。根据Utermark等和Vekiru等报道，ZEA常见的代谢途径是水解内酯环，然后脱羧，以及羰基的还原。得到的化合物如图2-5所示：

Figure 2-5 The chemical structure after the lactone ring of primary metabolite (M1) was hydrolyzed

图2-5所示化合物分子量与分子量为405的M2只差一分子水。从M2的二级质谱图中出现脱去一分子水的387碎片而没有脱去两分子水的368碎片也能够推测，405分子碳链上只含有一个羟基，因为酚羟基难以脱水。因此，推测在423的基础上发生了一个脱水反应，生成了图2-6所示的代谢物。

图2-6 次级代谢物（M2）结构图

Figure 2-6 The chemical structure of secondary metabolite (M2)

综上所述，推测菌株ANSB01G降解ZEA的代谢途径如下（图2-7）：

图2-7 ZEA代谢途径

Figure 2-7 The metabolic pathway of ZEA

三、DON降解产物结构分析

DON分子量是296，容易电离形成负离子331，因此，质谱检测采取负离子模式，测得质荷比为331。峰面积的大小可以表征溶液中化合物含量的多少。如图3-1所示，空白溶液中，完全不含有263；而在降解试验的不同时间点，331物质含量随时间增加而降低，120小时含量为最低值，表明在反应体系中随时间增加DON含量降低。

图3-1不同反应时间的DON及其降解产物（箭头指示）谱图

Figure 3-1 The mass spectrogram of DON and its degradation products in different reaction time

图3-2 DON降解产物质谱图

Figure 3-2 The mass spectrogram of DON degradation products

图3-2所示化合物分子量与分子量为331的DON，分子量相差2。推测可能是DON中C3-OH基团发生氧化生成了酮基。综上所述，推测菌株ANSB714降解DON的代谢途径如下（图3-3）：

图3-3 DON代谢途径

Figure 3-3 The metabolic pathway of DON

国内外有关DON生物降解的研究主要包括酶降解法和微生物降解法两种方式，而微生物降解是目前去除呕吐毒素污染研究的重点。有研究表明，DON结构中C12、 C13位的环氧基团和C3-OH基团是DON的主要毒性基团，也是生物降解主要研究位点（Pestka，2007）。 

本研究通过HPLC-MS/MS法对德沃斯氏菌ANSB714降解DON的作用机制进行研究。初步判断德沃斯氏菌ANSB714将DON降解成为3-keto-deoxynivalenol，将C3—OH基团氧化为酮基，从而降低DON毒性。Sato等（2011）从来自于土壤和小麦叶的微生物中分离出4种革兰氏阴性Devosia sp.属微生物和9种革兰氏阴性Nocardioides属微生物，分析检测这13种微生物可将DON转化成为3-epi-deoxynivalenol。Shima等（1997）通过富集培养方法从土壤中筛选得到一株土壤杆菌属的细菌E3-39，该菌在30℃厌氧条件下其胞外提取液可将培养基中200μg/mL的DON代谢掉，代谢产物中70%为3-酮基-DON。Völkl 等（2004）从自然界样品中分离出一株具有将DON降解为3-酮基-DON的细菌D107，该菌在20℃条件下保存6个月仍能保持对DON的降解能力。徐剑宏等（2010）筛选出一株德沃斯氏菌，并命名为DDS-1，该菌不但可以降解DON标准品，还可以降解饲料中的DON，并发现该菌首先把DON氧化成3-AC-DON，然后进行下一步反应。随后，徐剑宏等（2013）发现该德沃斯氏菌DDS-1在适宜的温度和稳定的pH以及金属离子作为辅因子条件下，产3-AC-DON氧化酶，首先把DON氧化成3-AC-DON，再往下氧化为3-酮基-DON，这一反应可使DON的毒性大大降低。