摘　要:黄曲霉毒素的强毒性和强致癌性严重威胁动物的生产性能和人类健康, 每年给食品工业、饲料工业和畜牧

业带来巨大的经济损失。由于物理和化学方法去除黄曲霉毒素存在种种应用缺陷, 目前生物降解黄曲霉毒素成为

安全、高效且环保的解毒方法而备受关注。本文就国内外黄曲霉毒素生物降解的研究作一综述, 同时对生物降解

应用前景进行展望。

关键词:黄曲霉毒素;生物降解;微生物

据联合国粮农组织(FAO)估计, 全世界谷物供应25 %受真菌毒素污染而不能食用, 其中受黄曲霉毒素污染最为严重。美国农业经济学家统计, 由于食用黄曲霉毒素污染的饲料, 每年至少要使美国畜牧业遭受10 %的经济损失。黄曲霉毒素(aflatoxin,AFT)是一类主要由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasi ticus)真菌产生的次级代谢产物, 具有极强的毒性。黄曲霉毒素已被世界卫生组织认定为ⅠA 级危险物(WHO ,1993)。黄曲霉毒素属于二呋喃氧杂萘邻酮的衍生物, 其分子结构中含有一个二呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)环, 现已分离出B1 、B2 、G1 、G2 、B2a 、G2a 、M1 、M2 、P1 等18 种之多, 其中以黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性和致癌性最强。黄曲霉毒素广泛存在于谷物、饲料和食品中, 畜禽摄入污染的饲料引起动物体重下降或者引发疾病, 间接通过食物链进入人体的黄曲霉毒素具有极强的致癌作用,严重威胁人类健康。各种动物对黄曲霉毒素均具有较高的敏感性, 低剂量会导致动物肝损伤,高剂量引发动物癌变致死。农作物在田间就会受到黄曲霉的污染, 收割后贮藏过程中如温度和湿度适宜, 黄曲霉孢子会大量繁殖产生更多的毒素, 在粮食和饲料的贮藏过程中不可避免产生毒素, 因此解决黄曲霉毒素污染谷物粮食和动物饲料是一个世界性难题。

传统的黄曲霉毒素去毒方法有物理和化学方法, 包括氨化法、碱法、高温法、紫外线照射法以及超滤-渗滤法等, 这些方法存在效果不稳定、营养成分损失较大以及难以规模化生产等缺点；目前还有添加霉菌吸附剂的办法, 这种方法在吸附毒素的同时会吸附一些营养成分, 也不能彻底去除黄曲霉毒素的毒性, 动物生产性能仍然受到很大的影响。因此,黄曲霉毒素污染的控制急切需要一种高效率、特异性强以及对饲料和环境没有污染的技术。利用微生物或其代谢产物进行解毒具备以上优势, 代表了生物解毒的新方向, 且生物酶催化方法具有专一性强、转化效率高的特点备受研究者的关注。

黄曲霉毒素生物降解, 是指黄曲霉毒素分子的毒性基团被微生物产生的次级代谢产物或者所分泌的胞内、胞外酶分解破坏, 同时产生无毒的降解产物的过程, 毒素生物降解是一种化学反应的过程, 不是对毒素的物理性吸附作用。目前国内外众多研究者已经发现包括细菌、真菌及酵母菌在内的大约上千种微生物能够使黄曲霉毒素含量降低, 但是大多研究只证明了所发现的微生物发酵液能显著降低黄曲霉毒素的浓度, 没有进一步证明这种作用是微生物的物理性吸附作用还是生物酶的生物降解作用。本文仅对国内外已被验证的黄曲霉毒素生物降解的研

究现状进行综述。

1 　黄曲霉毒素生物降解国内研究状况

1.1 　真菌生物降解黄曲霉毒素的研究

国内对黄曲霉毒素生物降解的研究较少。暨南大学刘大岭研究小组是研究黄曲霉毒素生物降解的机构, 他们发现从真菌假密环菌(Armillariella tabescens)中提取的粗酶液可使样品中的AFB1 含量减少80%。活性物质解毒作用的温度、pH 及时间等特征表明, 粗酶液中起解毒作用的是一种胞内酶。随后, 他们从该真菌的菌丝提取物中分离纯化出一种黄曲霉毒素解毒酶, 克隆得到其基因序列并成功转化到毕赤酵母表达系统中, 还对该酶的固定化技术进行了研究。然而此解毒酶的理想反应条件是中性pH , 高水分的体外反应体系, 适合植物油、酱油、啤酒以及牛奶等黄曲霉毒素的降解, 难以在籽实、饼粕等低水分饲料原料中直接应用。

陈仪本等研究发现, 黑曲霉(Aspergillus niger)菌丝体提取物BDA 能够降解花生油中的黄曲霉毒素。这种活性物质的解毒作用效率高, 温度(45～48℃)、pH(6～7)、水分以及时间等对其解毒反应的效应表明, 降解过程是酶促反应。考虑到酶促反应必须在水的存在下发生反应, 该研究小组选择了谷壳培养法将解毒酶固定化, 从而解决了酶制剂在含水量低的环境下难以作用的难题。上述2 种真菌的解毒作用源于细胞内提取物, 一般情况下, 微生物胞内物质产量极低, 且由于操作过程需要破碎真菌细胞或菌丝体, 程序繁琐, 容易破坏酶的活性,因此限制了其在实际生产中的应用。

1 .2 　细菌生物降解黄曲霉毒素的研究

中国农业大学动物营养学国家重点实验室2006 年在国家自然科学基金项目的资助下, 对细菌生物降解黄曲霉毒素及其降解机理进行了研究, 并取得很大进展。

首先是创建了香豆素培养基初步筛选微生物的方法，利用香豆素与黄曲霉毒素化学结构上的相似性, 假设能够降解香豆素的菌有可能降解黄曲霉毒素。该方法可以减少操作人员与黄曲霉毒素的接触, 操作过程安全，准确性高，已申请国家发明专利(申请号200910087595.8)。关舒、李俊霞等应用香豆素初筛，从动物粪便、发霉粮食和饲料、土壤等54 个样品中得到199 株细菌；再用AFB1 作底物进一步筛选,得到26 株有降解活力的菌株;对其中降解活性大于75%的9 株菌进行形态学观察和16S rDNA 鉴定。得到的9 株菌分别为：嗜麦芽窄食单胞菌(Stenot rophomonas mal tophilia)、橙红色粘球菌(Myxococcus fulv us )、克雷伯氏菌(Klebsiellasp .)、短波单胞菌(Brevundimonas sp .)、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei )、短状杆菌(Brachybacterium sp .)、纤维菌(Cellulosimicrobi -um sp .)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is)和炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)。

其次，Guan 等通过试验证明上述9 株菌中的嗜麦芽窄食单胞菌和橙红色粘球菌对黄曲霉毒素的作用是生物酶解作用。王宁等对其中来源于灰叶猴粪便的橙红色粘球菌经单因素试验和正交试验得到最优培养基(酵母粉为7 g/L,CaCl2·2H2O 为1g/L,MgSO4·7H2O 为0.5g/L ,VB12为750μg/L)和最佳发酵产酶条件(发酵时间为50 h，接种量20%，初始pH 为7.5，发酵温度为30℃,摇床转速160 r/min)，在最佳发酵条件下粘球菌对AFB1 的降解率达到78.2 %。

该课题组还对橙红色粘球菌所产降解黄曲霉毒素的胞外酶进行了初步分离纯化，并对其降解AFB1 的作用机制进行了研究。研究发现其胞外代谢产物有很强的解毒活性，而活菌细胞和胞内提取物解毒活性很低；试验用沉淀和层析技术对胞外代谢产物进行初步提取和纯化，用SDS-PAGE 电泳测定解毒蛋白的分子量，初步得到分子量范围为25～60 kDa 的3条蛋白带。通过对比解毒酶处理前后质谱和红外光谱变化，推测其作用机理与黄曲霉毒素中氧杂萘邻酮环的芳香内酯和甲氧基发生改变有关，这是不同于前人报道的新的解毒途径。本课题组所发现的能够降解黄曲霉毒素的新型活性蛋白已经申请国家发明专利得到保护(申请号200910092920 .X)，粘细菌黄曲霉毒素解毒酶是目前国内首先发现，并有深入研究的能够生物降解黄曲霉毒素的细菌所产胞外酶。

2 　黄曲霉毒素生物降解国外研究状况

2 .1 　真菌生物降解黄曲霉毒素的研究

国外对黄曲霉毒素生物降解研究较早，已发现许多霉菌和真菌的代谢产物能够降解黄曲霉毒素。早在20 世纪70 年代末，Detroy 等就报道AFB1 环戊烷环上的酮羰基可被树状指孢霉(Dactylium dendroide)生化降解。Cole 等也报道了AFB1 被少根根霉(R .Arrhizus)生物降解成异构羟基化合物。Doyle 等发现寄生曲霉能够产生降解AFB1 的乳过氧化物酶，并报道乳过氧化物酶的量与AFB1 被降解的量之间存在着直接的关系。Huynh 等报道，寄生曲霉在生长14 d以上时对AFB1 有很好的降解能力，但在生长4 d左右时年轻的菌丝体可能产生AFB1。Shantha发现茎点霉(Phoma sp.)能够降解AFB1达到99 %，并认为起作用的是茎点霉细胞提取物中的一种热稳定酶。Zjalic等对白腐菌(Trametes versicolor)进行了研究，认为其可能成为生物控制黄曲霉毒素的又一微生物资源。

Motomura 等从糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)的产物中分离纯化出分子量为90 kDa 的胞外酶，同时对该酶解毒反应的最佳pH(4～5)和温度(25℃)等反应条件进行了研究，荧光检测认为此酶可以断裂黄曲霉毒素的内酯环。虽然真菌能够降解黄曲霉毒素，但是这个过程非常的缓慢并且不完全，因此很少考虑用真菌代谢产物来去除饲料中的黄曲霉毒素。

2 .2 　细菌生物降解黄曲霉毒素的研究

细菌及代谢产物生物降解黄曲霉毒素的报道并不多, 研究认为解毒作用多源于胞外代谢产物。目前国外对细菌生物降解黄曲霉毒素的报道主要有橙色黄杆菌(Flavobacterium aurantiacum)、分支杆菌(Mycobacteriumf luoranthenivorans )和红串红球菌(Rhodococcus ery thropolis )。

Lillehoj等首先发现橙色黄杆菌能够去除溶液中的黄曲霉毒素。Line 等使用¹⁴C 标记AFB1与橙色黄杆菌反应并对放射性物质进行追踪和检测。研究发现, 无论活细胞还是死细胞均能够降低AFB1 含量，但活细胞的作用远大于死细胞，并且只有活细胞释放了被标记了的CO2 ，表明一定量的AFB1 被菌体细胞所代谢，这种方法也为研究AFB1在动物体内的代谢途径提供了参考。此外，他们还发现在pH 为7、温度为35℃，培养时间为72h 条件下，能够从溶液中最大限度的去除黄曲霉毒素且没有新的有毒物质产生，菌体浓度越高效果越好。Smiley 等报道橙色黄杆菌的粗蛋白质提取物在水溶液中可以降解AFB1，降解率能够达到74.5%；而用热处理失活的粗蛋白质只能降解5.5%的AFB1；用脱氧核糖核酸酶Ⅰ处理粗蛋白质后发现可以降解80.5%的AFB1，而用蛋白酶K 将粗蛋白质提取物处理后发现解毒能力降低到34.5%，这表明蛋白质对黄曲霉毒素的降解机理可能是酶促反应。

Hormisch 等以荧蒽为唯一碳源，从煤田附近污染的土壤样品中分离到一株能够同时降解荧蒽和AFB1 的分支杆菌，进一步试验证明其对黄曲霉毒素的降解是生物酶解作用。Teniola 等报道分支杆菌胞外提取物在30℃与AFB1 混合4 h后，降解率在90 %以上，8h 后基本检测不到AFB1 残留，还对胞外提取物在热处理和蛋白酶K 处理后进行了解毒效果测定，发现降解率降低了，因此，认为解毒机理是酶促反应。

Teniola 等从多环芳烃化合物污染的土壤中分离得到红串红球菌，其分泌的胞外酶具有较高的降解AFB1 的能力，通过对酶性质的研究，认为此酶在食品和饲料工业上有很大的开发应用潜力。Alberts 等用薄层色谱-高效液相色谱-电喷雾质谱-液相质谱(TLC-HPLC-ESMS-LCMS)，对红串红球菌降解AFB1 的机理进行研究，认为机理是其分泌的胞外酶对黄曲霉毒素的生物降解作用。

目前国外能够生物降解黄曲霉毒素的细菌除以上3 种有详细报道外，经数据库检索还包括Petchkongkaew等报道的芽孢杆菌(Bacillus spp.)，但其相关研究不够明确深入，有待进一步验证。

3 　黄曲霉毒素生物降解前景展望

前人对黄曲霉毒素生物降解的研究给我们新的启示，饲料中的黄曲霉毒素是可以通过生物酶降解作用得以去除的，并且在适宜的条件下生物酶的解毒不会产生其他有毒的化学物质，也不会损失或极少损失饲料中的营养物质。目前对于生物降解黄曲霉毒素的研究还存在许多不足之处，一般性的研究主要是侧重于降解菌株的筛选和菌株的降解能力，但是对于降解的机理及解毒酶特性缺乏深入的研究和探讨。

虽然黄曲霉毒素的生物降解研究已经有了很大进展, 但是由于微生物生物酶产量低、分离纯化过程复杂、酶性质的不稳定性和酶作用条件苛刻性等原因, 对黄曲霉毒素解毒酶在实际生产应用的研究很少。因此，筛选出能够产高效降解黄曲霉毒素的酶的菌株以及通过酶工程、基因工程等手段获得解毒作用条件更宽的解毒酶，是又一个研究方向。

4 　小　结

目前，国内外用生物学方法降解饲料中黄曲霉毒素的应用非常少，至今为止, 还没有关于生物酶降解饲料中黄曲霉毒素饲料添加剂的相关报道。因此，需要用到生物化学、分子生物学及基因工程等手段，对解毒酶粗提液进行分离纯化获得活性蛋白单一组分，同时对活性组分进行基因克隆及序列测定，并转化到载体中进行高效表达以提高黄曲霉毒素解毒酶产量，开发出高纯度、高活性的新型解毒酶饲料添加剂，这是饲料工业新的研究发展方向。饲料行业中对微生物酶研究最深入、应用最广且应用效果最好的酶制剂是植酸酶，我们期望微生物来源的黄曲霉毒素解毒酶是下一个给饲料工业和畜牧业带来经济效益的新型酶制剂。

转自：动物营养学报2010,22(2):241-245